清肺利咽颗粒UPLC指纹图谱研究

江洁怡，黄华靖，杨敏娟，李素梅，李养学，毕晓黎

（1.广东省中医药工程技术研究院，广东广州510095；2.广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州510095；3.广州中医药大学第五临床医学院，广东广州510405）

慢性咽炎为咽部黏膜、黏膜下及淋巴组织的慢性炎症，具有发病率高、病程久、复发率高、症状顽固、不易治愈等特点，严重影响着人们的正常生活。慢性咽炎属中医“喉痹”病证范畴[1]，清肺利咽颗粒为广东省第二中医院在中医药理论的基础上，根据中医临床经验处方开发而成的院内制剂，由玄参、天冬、知母、炒白芍、蝉蜕、射干、西青果、木蝴蝶、甘草、桔梗组成，其中玄参清热凉血、泻化滋阴，天冬养阴润燥、清肺生津，知母清热泻火、滋阴润燥，炒白芍养血敛阴，蝉蜕疏散风热、利咽开音，射干清热解毒、消痰利咽，西青果清热生津、利咽解毒，木蝴蝶清肺利咽，甘草酸甘化阴、调和诸药，桔梗祛痰利咽、引药入经，诸药合用，共奏清热养阴、利咽生津之功，临床上对慢喉痹虚火上炎证有良好的疗效。

该制剂临床应用多年，疗效确切，深受患者喜爱，为了进一步的开发推广，本课题组前期已采用薄层色谱法（TLC）建立了方中玄参、知母、炒白芍、甘草4 味药的定性鉴别方法，同时采用高效液相色谱法（HPLC）建立方中芒果苷的含量测定方法，但以上方法指标成分单一，难以对其内在质量进行全面控制。指纹图谱是基于多指标成分对中药制剂进行质量控制的有效手段，指纹图谱结合模式识别方法能有效弥补现有质量控制方法的不足[2]。本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）对12批清肺利咽颗粒进行指纹图谱研究，应用指纹图谱相似度评价结合主成分分析法进行分析，为清肺利咽颗粒的全面质量控制提供科学依据，为其开发成为安全有效、稳定可控的中药制剂奠定基础。

1 仪器与试剂

Agilent 1290 色谱仪（美国Agilent 公司）；KQ5200DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER XS205 DU 型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler‑Toledo 公司）；HH‑8 数显恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）；Milli‑Q Advan‑tage A10自动纯水机（美国MilliPore公司）。

乙腈、磷酸等液相用试剂为色谱纯（德国Merck公司），水为屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司），其余试剂均为分析纯（广州化学试剂厂）；清肺利咽颗粒[批号：20181001、20181002、20181003、20190401、20190402、20190403、20191001、20191002、20191003、20200401、20200402、20200403，依次编号为S1-S12，规格：每袋装15 g（每1 g 相当于饮片1.40 g）]由广东省第二中医院制剂室提供；没食子酸（批号：110831‑201204，纯度：91.5%）、芒果苷（批号：111607‑200402，纯度：98.1%）、芍药苷（批号：110736‑201741，纯度：96.8%）、鞣花酸（批号：111959‑201606，纯度：88.8%）、射干苷（批号：111632‑200501，纯度：98.7%）、黄芩苷（批号：110715‑201821，纯度：95.4%）、肉桂酸（批号：110786‑201604，纯度：98.8%）、黄芩素（批号：111595‑201808，纯度：97.9%）、次野鸢尾黄素（批号：111557‑200602，纯度：99.9%）对照品均购于中国食品药品检定研究院；羟基芍药苷（批号：Q‑019‑160627，纯度：＞98%）、芍药内酯苷（批号：S‑011‑180908，纯度：＞98%）、甘草酸铵（批号：G‑003‑150917，纯度：＞98%）对照品均购于成都瑞芬思生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters Cortecs T3（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）为色谱柱；柱温为25 ℃；以乙腈（A）‑0.1%磷酸（B）为流动相，进行梯度洗脱（0～3 min，5%→8%A；3～18 min，8%→25%A；18～25 min，25%→40%A；25～29 min，40%→60%A）；流速为0.35 mL/min；检测波长为245 nm、280 nm；进样量为1 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液取清肺利咽颗粒适量，研细，精密称取约2 g，置100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入50%（体积分数，下同）甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz）30 min，放冷至室温，再次称定质量，并用50%甲醇补足减失的质量，超速离心（转速：10 000 r/min）5 min，取上清，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液分别精密称取没食子酸、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芒果苷、芍药苷、鞣花酸、射干苷、黄芩苷、肉桂酸、黄芩素、甘草酸铵、次野鸢尾黄素对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL 含343.6、1310、159.1、218.4、306.2、256.0、103.6、247.1、21.36、223.8、135.6、151.2 μg的对照品溶液，备用。

2.3 指纹图谱的建立

2.3.1 精密度试验取同一供试品溶液（S12），按“2.1”项色谱条件，连续测定6 次，记录色谱图，以芍药苷（8 号峰）为参照，计算出23 个共有峰的相对保留时间（RRT）及相对峰面积（RPA），结果RSD 均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验取同一供试品溶液（S12），按“2.1”项色谱条件，分别于供试品溶液制备后第0、2、4、6、8、12 h 进样测试，记录色谱图，以芍药苷（8 号峰）为参照，计算出23个共有峰的RRT及RPA，结果RSD 均小于2%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验分别取同一批次样品（S12），按“2.2”项供试品溶液制备方法，平行处理6 份供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件，进样测定，记录色谱图，以芍药苷（8 号峰）为参照，计算出23 个共有峰的RRT 及RPA，结果RSD 均小于2%，表明方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度评价分别取12批清肺利咽颗粒样品，按“2.2”项方法制备供试品溶液，再分别精密吸取各对照品溶液适量，加甲醇配制成分别含没食子酸34.36 μg/mL、羟基芍药苷39.30 μg/mL、芍药内酯苷7.955 μg/mL、芒果苷10.92 μg/mL、芍药苷45.92 μg/mL、鞣花酸51.20 μg/mL、射干苷5.180 μg/mL、黄芩苷12.36 μg/mL、肉桂酸2.136 μg/mL、黄芩素11.19 μg/mL、甘草酸铵13.56 μg/mL、次野鸢尾黄素7.560 μg/mL 的混合对照品溶液，吸取上述混合对照品溶液1 μL，按“2.1”项色谱条件进样测定，同时记录245 nm、280 nm 下色谱图，并分别将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0 版）”，以S12 为参照图谱，以中位数法，时间窗0.1 min，全谱自动匹配，生成对照指纹图，见图1-2。共标定了23 个峰为特征峰，通过与对照品保留时间及紫外吸收光谱比对，归属指认了其中2 号峰为没食子酸、4 号峰为羟基芍药苷、5 号峰为芍药内酯苷、6 号峰为芒果苷、8 号峰为芍药苷、10号峰为鞣花酸、11号峰为射干苷、16号峰为黄芩苷、17号峰为肉桂酸、19号峰为黄芩素、21号峰为甘草酸铵、22号峰为次野鸢尾黄素，见图3。

图1 12 批清肺利咽颗粒UPLC 叠加图谱和对照指纹图谱（245 nm）Figure 1 UPLC characteristic chromatograms overlapping and comparison fingerprint of 12 batches of Qingfei Liyan granule(245 nm)

12 批清肺利咽颗粒供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.99，见表1。结果表明，12批次样品所含化学成分相似，清肺利咽颗粒原药材质量与制剂工艺较稳定。

2.3.5 化学模式识别分析

图2 12 批清肺利咽颗粒UPLC 叠加图谱和对照指纹图谱（280 nm）Figure 2 UPLC characteristic chromatograms overlapping and comparison fingerprint of 12 batches of Qingfei Liyan granule(280 nm)

图3 清肺利咽颗粒UPLC图谱Figure 3 UPLC chromatograms of Qingfei Liyan granule

表1 相似度评价结果Table 1 Similarity evaluation results

2.3.5.1 聚类分析以指纹图谱中23 个共有峰的峰面积标准化处理后数据为变量，运用SPSS 26.0 软件对12 批清肺利咽颗粒样品进行系统聚类分析（CA），采用组间联接聚类法，选取平方Euclidean 距离作为度量标准，全距从0～1作标准化，进行聚类分析，结果见图4。从树状图结果得知，当平方Euclidean距离为15时，12个样品被分为两类，S7-S9为一类，其他批次聚为一类，其中S7-S9 批次为2019 年10月生产的3 批样品，聚类分析能将不同时间生产的样品进行初步的分类，表明清肺利咽颗粒的质量受到原药材质量等条件影响，为制剂生产的原药材质量把控提供了实验依据。

图4 系统聚类分析图Figure 4 System cluster analysis

2.3.5.2 主成分分析以指纹图谱中23个共有峰的峰面积标准化处理后数据为变量，运用SIMCA 14.1软件对12 批清肺利咽颗粒样品进行主成分分析（principal components analysis, PCA），选取特征值最大的两个主成分进行拟合分析，其累积方差贡献率分别为70.01%、84.8%，得到12 批清肺利咽颗粒样品的PCA 得分图，见图5。结果显示所有样品均在95%可信区间内，且能分为两类，S7-S9 为一类，其他批次为一类，与CA分析结果一致。

图5 PCA分析得分图Figure 5 PCA score

以指纹图谱中23 个共有峰的峰面积标准化处理后数据为变量，运用SPSS 26.0 软件对12 批清肺利咽颗粒样品进行PCA 分析，以特征值大于3 为判断标准，得主成分特征值、方差贡献率和主成分因子载荷矩阵，见图6、表2-3。其中，前2个成分的特征值分别为16.10、3.413，累计方差贡献率分别为70.01%、84.8%，表明前2 个主成分能够充分体现出样品的基本特征和主要信息，与SIMCA 14.1结果一致。通过因子载荷矩阵得知，峰1、2（没食子酸）、3、4（羟基芍药苷）、5（芍药内酯苷）、6（芒果苷）、8（芍药苷）、9、11（射干苷）、12、15、16（黄芩苷）、17（肉桂酸）、18、19（黄芩素）、20、21（甘草酸铵）、22（次野鸢尾黄素）、23在主成分1上有较高载荷，对主成分1 产生主要影响；峰6（芒果苷）、7、10（鞣花酸）在主成分2 上有较高载荷，对主成分2 产生主要影响。表明上述成分在特征变量的重要性评估中具有优势，对其进行含量监测，对清肺利咽颗粒的质量控制具有重要的意义。

图6 PCA分析碎石图Figure 6 PCA scree plot

表2 特征值与方差贡献率Table 2 Eigenvalue and variance contribution rate

表3 主成分因子载荷矩阵Table 3 Factor loading matrix

3 讨论

由于复方制剂成分复杂，不同组成在不同波段的吸收强度有较大的差异，在检测波长考察过程中，采用紫外210～400 nm 全波长扫描，结果发现245 nm 处，能包含绝大部分成分的色谱峰，但仍有部分成分245 nm 不出峰或吸收较弱；而同时对280 nm 进行检测，可兼顾245 nm下不出峰的成分，且280 nm 接近部分含测指标成分的最大吸收，在此波长下进行含量测定，可增加结果的准确度，故最终选择同时检测245 nm、280 nm。先后考察了不同色谱柱（Waters CORTECS UPLC T3、Waters ACQUI‑TY UPLC BEH Shield RP C18、Phenomenex Kinetex XB C18）、不同流动相体系（乙腈‑水、乙腈‑0.1%甲酸、甲醇‑0.1%磷酸）、不同柱温（20、25、30 ℃）以及不同流速（0.25、0.30、0.35 mL/min），最终确定了“2.1”项下色谱条件。

清肺利咽颗粒由玄参、天冬、知母、炒白芍、蝉蜕、射干、西青果、木蝴蝶、甘草、桔梗等水煎、浓缩、制粒而成，其中玄参中的肉桂酸成分，具有抗氧化、抗菌、神经保护等作用[3‑4]；知母所含的芒果苷具有镇咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗炎、抗菌等作用[5‑6]；以芍药苷和芍药内酯苷为代表的单萜及其苷类成分是白芍中公认的药效物质，具有广泛的抗炎镇痛、减毒增效等作用[7‑8]；没食子酸、鞣花酸等多酚是西青果中主要药效成分，具有抗氧化、抗炎抑菌等作用[9‑11]；黄芩苷、黄芩素等黄酮类成分为木蝴蝶发挥抗氧化、抗炎抑菌药理作用的主要成分[12‑13]；射干苷、次野鸢尾黄素等黄酮类成分是射干中的主要药效成分，具有抗氧化、抗炎抑菌等作用[14‑15]；甘草具有清热解毒、祛痰止咳的作用，其中甘草酸具有抑菌、抗病毒等作用[16‑17]。本研究建立了全方指纹图谱，并对方中所含的没食子酸、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芒果苷、芍药苷、鞣花酸、射干苷、黄芩苷、肉桂酸、黄芩素、甘草酸铵、次野鸢尾黄素等12个成分进行指认与控制，指标成分兼顾君臣佐使，对清肺利咽颗粒的质量控制达到整体、全面的效果。

据报道，方中玄参、知母、桔梗等药味中，仍存在系列的皂苷类活性成分，此类成分难以通过紫外检测器进行测定，需采用蒸发光检测器（ELSD）等[18]，下一步将继续对其测定方法进行探索。

12 批清肺利咽颗粒指纹图谱相似度较高，制备工艺、质量较稳定，质量差异主要表现在各成分含量上，各批次之间的成分含量差异可能与投料药材的产地、采收期等因素有关，仍需对其药材来源进行进一步的分析、控制，以保证产品质量的稳定性。本研究仅从化学成分层面出发，对清肺利咽颗粒质量进行控制，下一步可结合药理研究，明确其质量标志物，保证产品的安全、有效。