冻害胁迫下水处理对茶树抗寒生理指标的影响

孙霞 宋大鹏 刘加英 袁安友 韩顺英 丁仕波

摘要：为探究水处理对茶树冻害胁迫的效应，以中茶108为材料，在不同水处理条件下，采用人工气候室模拟冬季冻害的发生，测定茶树叶片中多项生理生化指标的变化规律。结果表明，茶树叶片中过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均受低温胁迫诱导，开始降温时，除丙二醛含量下降外，其余均呈上升趋势。“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的茶树叶片中POD和SOD活性，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于不浇水处理，丙二醛含量变化趋势则与之相反，不同处理间差异极显著;CAT活性无显著差异。浇水处理有利于茶树多个抗寒生理指标的改变。

关键词：茶树;水处理;冻害胁迫;生理指标

Effects of Water Treatmenton Cold-resistant

Physiological Indexes of Camellia

sinensis under Freezing Stress

SUN Xia1， SONG Dapeng1， LIU Jiaying1， YUAN Anyou1， HAN Shunying2， DING Shibo1*

1. Tea Research Institute， Rizhao Academy of Agricultural Sciences， Rizhao 276800， China;

2. Agricultural Comprehensive Service Center of Kouguan Town， Rizhao 276800， China

Abstract： To study the effects of water treatment on cold-resistant physiological indexes， Camellia sinensis cv. Zhongcha 108 was selected to detect some physiological indexes of leaves under freezing stress. The results showed that the activities of POD （peroxidase）， SOD （superoxide dismutase） and CAT （catalase） were induced by low temperature stress， also the contents of proline， MDA， soluble sugar and soluble protein were similar. At the beginning of cooling， MDA content decreased and the others increased. During the stress process of "low temperature-freezing-low temperature"， the activities of POD and SOD， the contents of proline， soluble sugar and soluble protein in tea leaves treated with watering were higher than those without watering treatment， while the change trend of MDA content was opposite. Furthermore， there was significant differences in six physiological indexes between watering treatment and the control， In contrast， there was no significant difference in CAT activity. During freezing stress， watering treatment would cause the changes of several cold-resistance physiological indexes of tea plants.

Keywords： Camellia sinensis， water treatment， freezing stress， physiological index

植物凍害（Plant frost）是造成高纬度地区越冬农作物减产、绝产的气象灾害之一，冬季土壤水分含量与作物存活率密切相关[1-2]，合理灌溉是保障作物安全越冬的一项重要措施[3-5]。越冬作物自身通过调节可溶性糖、氨基酸、丙二醛等含量或相关酶活性的变化，参与渗透调节、低温保护以及细胞膜的合成、流动和稳定性等多个方面，增强自身对一定程度冻害的耐受性[6-16]。

茶树喜温怕寒，冬季的极端低温和初春的“倒春寒”是影响茶树生长和繁殖的重要因素[17-18]。山东茶区是中国茶树栽培的最北线，纬度较高，季风性气候明显，冬季寒冷干燥，茶树极易受到冻害，越冬需要进行防护，生产成本高。冻害一直是制约山东茶产业高质量发展的主要瓶颈。山东茶区冬季缺水较严重，研究表明，茶树代谢活动受到影响，抗逆性显著降低，在立冬后茶园浇足浇透越冬水，有利于减轻冻害[19-23]。茶树受到冻害胁迫时，众多的基因、基因家族和代谢通路等也参与了这一复杂的生理生化过程[24-34]，但茶树抗冻机理至今尚未完全明确。而模拟自然条件下，“低温—冻害—低温”胁迫发生时，伴随着温度和时间的改变，不同水处理条件下茶树体内一些与抗寒相关生理指标的变化鲜见报道，相关研究对冬季山东省茶树安全越冬具有指导和借鉴的意义。

1  材料与方法

1.1  试验材料

供试材料为山东日照市农业科学院茶叶研究所茶园的2年生中茶108茶苗。

1.2  试验设计

随机选取100株生长良好且长势一致的茶树苗移栽至人工气候室内。光照12 h（3 500 lx，24 ℃），黑暗12 h（16 ℃），空气湿度80%，正常田间管理，培养180 d。设置浇水（Tn，土壤深20 cm处含水量为30%）和不浇水（Cn，土壤深20 cm处含水量为15%）2个处理，浇水10 d后开始“低温—冻害—低温”的胁迫处理，空气湿度降至60%。

从10 ℃24 h时开始，梯度降温（1 ℃/h）至0 ℃时1 h，?7 ℃时0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h;随后梯度升温（1 ℃/h）至0 ℃时1 h，10 ℃时0 h、12 h和24 h时分别摘取茶树顶端第2～4片成熟叶（至少5株，3次重复），低温蒸馏水快速洗净，滤纸吸干，液氮冷冻，?70 ℃超低温冰箱保存，备用。

1.3  植物生理生化指标检测

低温称取1.00 g样品，加入1 000 μL PBS溶液（pH=7.2），充分研磨粉碎，移入1.5 mL离心管中，4 000 r/min离心30 min，收集上清，冷冻备用。

依据酶聯免疫试剂盒（ELISA，酶联生物）使用说明，测定样品中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性;脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白的含量。

1.4  数据统计分析

使用Excel 2019和GraphPad Prism5进行数据分析和图表绘制。

2  结果与分析

2.1  不同水处理茶树叶片POD活性的变化

在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的叶片中POD活性均高于不浇水处理（图1）。POD活性明显受低温胁迫诱导，处理开始温度10 ℃/24 h时，浇水和不浇水处理的POD酶活性分别为177.73 U/mL和126.78 U/mL;降至0 ℃/1 h时，不同水处理的POD活性均升高，不浇水处理的达到最大值170.82 U/mL。

随着冻害胁迫（?7 ℃）持续时间的延长，POD活性均呈下降趋势;冻害胁迫结束后，随着温度的升高，浇水处理的POD活性上升趋势明显，在10 ℃/12 h时达到最大值220.85 U/mL，随后下降，10 ℃/24 h时POD的活性降至124.68 U/mL;不浇水处理的POD活性随着气温升高，呈持续下降趋势，气温升至10 ℃/0 h时POD活性降至最低49.33 U/mL，约为最高值的1/3，随后活性维持低位水平，10 ℃/24 h时的POD活性达到73.72 U/mL。

2.2  不同水处理茶树叶片SOD活性的变化

在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的SOD活性均高于不浇水处理（图2）。SOD的活性明显受低温胁迫诱导。处理开始温度降至10 ℃/24 h时，浇水和不浇水处理的SOD活性分别为75.20 U/mL和50.81 U/mL;降至0 ℃/1 h时，不同水处理的SOD活性均升高，但升高幅度存在差异，不浇水处理的SOD活性达到最大值87.29 U/mL;随着冻害胁迫（?7 ℃）持续时间的延长，SOD活性呈下降趋势;冻害胁迫结束后，随着温度的升高，浇水处理的SOD活性呈上升趋势，在10 ℃/12 h时达到最大值131.19 U/mL，10 ℃/24 h时SOD的活性降至79.81 U/mL;而不浇水处理SOD活性随着温度升高呈下降趋势，10 ℃/24 h时的SOD活性降至最低值20.17 U/mL。

2.3  不同水处理茶树叶片CAT活性的变化

在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，不同水处理间的茶树叶片CAT活性差异较小（图3）。CAT活性受低温胁迫诱导，处理开始当温度降至10 ℃/24 h时，浇水和不浇水处理的CAT活性分别为31.25 U/mL和25.75 U/mL;当温度降至0 ℃/1 h时，CAT活性均升高，达到最大值，分别为39.89 U/mL和47.30 U/mL，不浇水处理的CAT活性增加约1倍;随着冻害胁迫（?7 ℃）时间的延长，CAT活性均略有下降后维持在较高水平波动，不同水处理间差异较小;冻害胁迫结束，升温过程中，不同水处理间CAT活性呈持续下降，在10 ℃/24 h时降至最低值，分别为12.40 U/mL和18.62 U/mL，均低于检测初始时的CAT活性，且浇水处理的CAT活性下降幅度大于不浇水处理。

2.4  不同水处理茶树叶片脯氨酸含量的变化

在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的叶片中脯氨酸含量均高于不浇水处理（图4）。处理开始降温至10 ℃/24 h时，浇水处理的叶片中脯氨酸含量（23.75 ng/mL）高于不浇水处理（21.91 ng/mL）;伴随着温度的下降，不同水处理间脯氨酸含量的积累量和积累强度呈上升趋势;浇水处理脯氨酸含量在温度降至0 ℃/1 h时达到最大值37.66 ng/mL，冻害来临时（?7 ℃）含量略有下降，但仍维持在较高含量水平波动，冻害后升温过程中脯氨酸含量积累虽有波动，但均高于初始检测值。

不浇水处理在降温和冻害来临时脯氨酸含量增加强度较低，积累响应慢于浇水处理，在?7 ℃/0 h达到最大值（34.62 ng/mL），然后缓慢下降波动，在冻害结束后，温度升至10 ℃/12 h时达到最低值16.42 ng/mL，约为最高值的1/2。

2.5  不同水处理茶树叶片丙二醛含量的变化

在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的叶片中丙二醛含量均低于不浇水处理（图5）。处理开始温度降至10 ℃/24 h时，不同水处理间的丙二醛含量差异极小，均约为4.6 nmol/mL，随着温度和时间改变，丙二醛的含量都呈“先降后升”的趋势;丙二醛含量最低点均出现在冻害胁迫时，不浇水处理为3.525 nmol/mL（?7 ℃/18 h），浇水处理为2.676 nmol/mL（?7 ℃/30 h）;冻害结束升温过程中，丙二醛含量的积累呈上升趋势，水处理的丙二醛含量增幅小于不浇水处理，在温度升至10 ℃时丙二醛含量超过初始含量达到最大值，浇水和不浇水处理分别为5.468 nmol/mL（10 ℃/12 h）和6.231 nmol/mL（10 ℃/24 h）。

2.6  不同水处理茶树叶片可溶性蛋白含量的变化

在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的可溶性蛋白含量均高于不浇水处理（图6）。可溶性蛋白质含量受低温胁迫诱导增加，降温过程中，在处理开始的10 ℃/24 h时浇水处理叶片中可溶性蛋白含量为918.70 μg/mL，不浇水处理的仅695.63 μg/mL，0 ℃/1 h时可溶性蛋白含量均达到最大值，分别为991.25 μg/mL和805.40 μg/mL;冻害胁迫过程中，随着胁迫时间的延长，可溶性蛋白含量和积累强度呈波动下降趋势，但整体波动较小，维持在高位水平;后期升温过程中，可溶性蛋白含量呈先升后降的趋势，10 ℃/24 h时达到最低值，浇水和不浇水处理分别为531.68 μg/mL和410.66 μg/mL。

2.7  不同水处理茶树叶片可溶性糖含量的变化

在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的可溶性糖含量和积累强度均高于不浇水处理（图7）。可溶性糖含量和积累强度受低温胁迫诱导增加，处理开始的10 ℃/24 h时，浇水处理叶片中可溶性糖含量（234.33 μg/mL）高于不浇水处理（153.29 μg/mL）。

随着温度降低，浇水处理的可溶性糖积累量在0 ℃/1 h时达到最大值291.72 μg/mL，不浇水处理的可溶性糖积累在冻害发生后-7 ℃/30 h时达到最大值171.53 μg/mL;在冻害结束后升温至10 ℃/24 h时，浇水处理和不浇水处理可溶性糖含量均降至最低值，分别为185.59 μg/mL和134.165 μg/mL。

3  讨论

植物冻害是指气温降至冰点以下，植物因细胞间隙结冰而受到的伤害。植物受冻后，会在其局部表现出干枯失水、开裂、萎蔫等现象，而冻害发生前后伴随着低温胁迫。

冻害胁迫过程中，植物体内发生一系列适应性生理变化，多种保护性物质积累。目前普遍认为，植物低温伤害时最先受冲击的是其生物膜系统，从而导致电解质外渗，细胞内区域化削弱甚至丧失，并因其膜结合酶构象改变，导致植物细胞代谢和功能紊乱。

植物可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸作为渗透调节物质，对生物膜具有稳定和保护作用，其含量可以反映植物对非生物胁迫的耐受能力;而丙二醛作为细胞膜脂过氧化作用的最终产物，一定程度可以反映植物受逆境胁迫伤害的程度[11-12，14-16，35]。

本研究中，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均受低温胁迫诱导增加，随着低温胁迫温度下降和时间的延长，浇水处理的3种渗透调节物质的含量均在冻害来临前（0 ℃/1 h）达到最大值，不浇水处理的3种渗透调节物质增幅、最大值出现的时间均低或晚于浇水处理。在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于不浇水处理，而丙二醛含量的检测结果与之相反。与前人的研究结果[7，36-46]基本一致，说明水处理可以提高茶树对“低温—冻害—低温”的耐受性。

抗氧化酶系统被认为是植物遭受环境胁迫时重要的防御体系，研究逆境胁迫下抗氧化酶系统的响应，是揭示植物抗逆机理的重要环节[47]。植物受到胁迫时，为维持正常的生长，启动氧化物清除机制，抗氧化酶系统中的SOD、CAT和POD等相互协调，在共同抵御胁迫中发挥着重要的作用[6-10，13，35，48-49]。

本研究中，POD、SOD和CAT活性均受低温胁迫诱导，随着低温胁迫温度下降和时间的延长，3种酶活性均增加，接近或达到最大值;但在冻害胁迫过程中和随后升温时，3种酶活性变化并不完全一致，同一种酶在不同处理间的活性变化也不完全相同。在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，浇水处理的POD和SOD活性均高于不浇水处理，浇水处理的POD和SOD活性变化呈双峰M型，高峰值分别出现在降温的0 ℃/1 h和升温的10 ℃/12 h两个时间点，“低温—冻害—低温”胁迫结束时的POD和SOD活性均低于初始检测值;而不浇水处理的POD和SOD活性和不同水处理的CAT活性均呈偏单峰曲线，高峰值出现在降温的0℃/1 h时，冻害胁迫时活性略有下降，但维持在较高水平波动，随着后期温度的升高，3个酶活性维持下降趋势，但最低值出现的时间存在差异;在“低温—冻害—低温”胁迫过程中，不同浇水处理的CAT活性变化差异未达显著水平，且升温10 ℃/24 h时的CAT活性不浇水处理高于浇水处理。

本研究中，POD和SOD活性与植物的抗寒性密切相关，冻害发生前的浇水处理可以提高植物的冻害胁迫耐受性，与前人研究結果相同[3-5，43，46];而CAT活性在“低温—冻害—低温”胁迫过程中虽多个取样点浇水处理高于不浇水处理，CAT活性与茶树在冻害胁迫耐受性方面的关系不大，与林郑和等[45]研究结果的差异可能与茶树品种选择和“低温—冻害—低温”的试验设计等有关。

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