2 例金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎分离鉴定及药敏试验

张国华，吕思文，金振华，王丽坤，张 莹，张 备，李 烨，薛沾枚

（1. 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 116000；2. 齐齐哈尔市龙沙区农业综合行政执法大队，黑龙江齐齐哈尔 116000）

奶牛乳房炎是奶牛养殖业中的常见病[1]，可导致奶牛产奶量下降，影响乳制品品质，也可能对消费者的身体健康造成不良的影响，对养殖业造成很大的经济损失[2]。奶牛乳房炎可能由多种因素引起，其中细菌对该病的发生影响很大。引起奶牛乳房炎较为多见的致病菌为大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌等[3]，以金黄色葡萄球菌较为常见。目前，对奶牛乳房炎多采用常规的抗生素进行治疗，极易产生耐药性，导致奶牛乳房炎难以治愈。

黑龙江主要养殖的奶牛品种为中国荷斯坦奶牛、西门塔尔牛等，奶牛存栏量居全国前列，且每年保持着较大增幅。乳房炎严重影响本地奶牛养殖业发展，如何有效治疗奶牛乳房炎是畜牧从业者需要深入研究的热点问题。为避免出现耐药性，应杜绝盲目使用抗生素，可采用无抗饲养模式提高奶牛的抵抗力，抵御疾病发生。若发生奶牛乳房炎，应使用科学合理的手段对疾病进行诊疗，确定感染细菌的种类，针对不同的细菌精准用药可有效治疗疾病，降低疾病造成的损失[4]。黑龙江地区某奶牛养殖场发生奶牛产奶量下降、体细胞数明显上升、产奶中带血等情况。本试验对该场发病奶牛的乳样进行细菌分离培养，对分离菌株进行生化试验、16S rDNA 鉴定、基因序列比对分析、药物敏感性试验等，并给出针对该细菌的敏感性药物，指导临床用药，为奶牛乳房炎的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集黑龙江地区某奶牛养殖场2例乳样。清洗消毒病牛乳头，弃去20 mL乳样，无菌采集5 mL乳液取回，进行细菌分离鉴定。昆明小鼠购自齐齐哈尔医学院。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：血平板培养基（青岛海博生物技术有限公司）、革兰氏染色试剂（北京索莱宝科技有限公司）；药敏片、细菌微量生化管（杭州微生物试剂厂），DP302 DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR exTap Master Mix（大连宝生物工程有限公司）。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

主要仪器：2720PCR 仪（美国ABI 公司）、凝胶成像系统和电泳仪（北京六一仪器设备厂）、BHC-1300IIA生物安全柜（苏州净化设备有限公司）、恒温培养箱（上海一恒仪器设备公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌的分离和培养

将取回的乳液于无菌环境下操作，13 000 r/min 离心10 min，取下层沉淀100 μL接种于血平板培养基，37 ℃培养16 h，进行革兰氏染色，观察细菌形态。

1.3.2 生化试验

将分离到的细菌根据镜检结果进行初步判断，进行生化试验确认细菌的种类。

1.3.3 16S rDNA鉴定（见表1）

表1 16S rDNA引物Tab.1 16S rDNA primer

提取细菌DNA，16S rDNA 引物根据参考文献[5]进行设计。扩增产物于1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析，与预期结果相符后将胶回收产物送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序，测序结果于GENEBANK上进行比对分析。16S rDNA引物见表1。

1.3.4 动物试验

采用灭菌的吸头点取单菌落，接种于营养肉汤培养基，加入5%犊牛血清，37 ℃培养16～24 h，制备单位浓度为3×108CFU/mL的菌液。

取15只昆明小鼠进行试验，试验组小鼠腹腔注射菌液0.3 mL/只，每个菌株注射5 只昆明小鼠。设置1 个对照组注射等量的营养肉汤培养基，观察试验验组和对照组小鼠是否出现死亡或发病症状。对接种细菌后发生感染死亡的小鼠脏器内的细菌进行分离鉴定。

1.3.5 药敏试验

试验根据美国临床检验标准委员会（NCCLS）（2017）推荐的K-B纸片法进行操作实施[6]。选取丁胺卡那、恩诺沙星、环丙沙星、多西环素、链霉素、头孢噻肟等6 种药敏片，将细菌均匀涂布于血平板，37 ℃培养16 h，观察药物敏感性试验结果。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果

将分离得到的两株菌株命名为HQ-1、HQ-2，分别接种于血平板培养16 h，菌落均呈为光滑、湿润、微微隆起的水珠样菌落。革兰氏染色显示分离株为革兰氏阳性菌，细菌呈球状，单个或几个在一堆、或呈葡萄串状，可初步判定分离得到的细菌为金黄色葡萄球菌。

2.2 生化试验结果（见表2）

表2 生化试验结果Tab.2 Biochemical tests results

由表2可知，两株菌株均能够发酵蔗糖、蕈糖、乳糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、葡萄糖；无法发酵山梨醇、木糖醇。尿素酶试验、VP、甲基红试验阳性；无法还原硝酸盐。过氧化氢酶试验有气泡产生，呈阳性。参照《伯杰氏系统细菌学手册》，生化鉴定结果与金黄色葡萄球菌特性相符，确定两株分离株均为金黄色葡萄球菌。

2.3 16S rDNA PCR鉴定结果（见图1）

图1 16S rDNA PCR鉴定结果Fig.1 16S rDNA PCR results

由图1可知，2株菌株经DNA提取、PCR鉴定扩增出两条长度约1 465 bp 的特异性条带。将PCR 产物送至库美进行测序，序列结果经比对，与ATCC12600 株（NR_118997）同源性分别为95.56%、96.38%。

2.4 动物致病性试验结果

菌液接种24 h后试验组小鼠全部死亡，对照组小鼠正常。对死亡小鼠进行剖检，发现小鼠肝脏肿大；将试验组小鼠的肝脏于无菌环境下采集样本，进行细菌分离鉴定，显示分离得到的细菌与原细菌为同种细菌；进行单菌落DNA提取以及扩增、测序，结果显示与原细菌相同。

2.5 药敏试验结果（见表3）

表3 分离菌株的药敏试验结果Tab.3 Results of isolated strains susceptibility test

结果根据CLSI的指导判定为药物敏感（S）、中等敏感（I）、耐药（R）[4]。由表2可知，两株金黄色葡萄球菌的药敏试验结果一致，均对丁胺卡那这类抗生素有较高的敏感性，对恩诺沙星、环丙沙星中介，对多西环素、链霉素、头孢噻肟耐药。

3 讨论

葡萄球菌作为一种环境中常在菌类，由于环境等因素变化，可能引发致病性，对人类和动物养殖业的安全均具有一定影响[7]。如奶牛感染葡萄球菌可引起乳房炎等多种疾病，严重危害奶牛养殖业的健康有序发展[8-10]。本试验通过对黑龙江地区两例奶牛乳房炎样本进行分离鉴定，确定引起乳房炎的致病菌为金黄色葡萄球菌，与ATCC12600株（NR_118997）同源性高达95.56%～96.38%；药物敏感性试验筛选此菌株敏感性药物为丁胺卡那，进行治疗后效果显著，发病奶牛症状迅速消退。药敏试验结果显示，分离株多西环素、链霉素、头孢噻肟耐药，说明HQ-1、HQ-2 株细菌对于抗生素已产生了一定耐药性。研究发现，若奶牛发生乳房炎等疾病，应查找病因并运用现代诊疗方案对疾病进行精准的治疗和有效的预防[11]，切忌盲目用药。盲目用药可能导致病程加长[12]、治疗效果不佳、经济损失加重等不良后果。

董志民等[13]在东北地区3 个规模化奶牛养殖场对330 份样本进行检测，分离得到表皮葡萄球菌32 株、腐生葡萄球菌34株，所得菌株对青霉素、苯唑西林和林克霉素的耐药率较高。刘通等[14]对黑龙江某规模化奶牛养殖场急性乳房炎样本进行分离鉴定，结果显示，葡萄球菌单独感染1例，葡萄球菌和链球菌混合感染4例，葡萄球菌和酵母菌混合感染2例，感染葡萄球菌样本占总样本数的70%。张艳等[3]对黑龙江某规模化奶牛养殖场乳腺炎样本进行分离鉴定，结果显示，分离得到大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和蜡样芽孢杆菌，所得菌株对环丙沙星和左氧氟沙星高度敏感。

因此，葡萄球菌在东北地区奶牛乳房炎的感染较为多见，且均产生了不同程度的耐药性。为增加养殖户的收益，降低奶牛乳房炎造成的经济损失，应加强饲养管理，定期进行环境消毒及牛群免疫[15]，保证饲料质量且饲喂营养全面的饲料[16]。若发生疾病，应运用科学合理的手段进行治疗，避免长期使用单一药物引起耐药性[17]，为助力养殖业健康有序的发展做出贡献。

4 结论

本试验采集的2 份乳房炎样本，符合金黄色葡萄球菌的形态鉴定，镜检可见葡萄串状的球形革兰氏阳性菌。生化试验结果符合金黄色葡萄球菌生化特性；16S rDNA 序列鉴定扩增得到大小为1 465 bp 左右的特异性条带，与ATCC12600 株（NR_118997）同源性为95.56%、96.38%，确认分离株金黄色葡萄球菌HQ-1、HQ-2。通过动物试验说明两株细菌均具有较强的致病性。药敏结果显示，分离株对丁胺卡那敏感。通过试验确认本次奶牛乳房炎为感染金黄色葡萄球菌引起，为黑龙江地区奶牛乳房炎的治疗做出指导，为未来奶牛乳房炎的研究提供参考。