26份玉米材料灰斑病抗性鉴定及分子标记检测

周雪琴， 袁艳丽， 任 洪， 王 伟， 柏光晓

(1.贵州大学农学院， 贵阳 550025； 2.贵州省农业科学院旱粮研究所， 贵阳 550006)

玉米灰斑病(gray leaf spot，GLS)是发生在玉米叶部的一种严重病害，最早于1925年在美国的伊利诺斯州首次被Tohon和Daniels报道[1]。1992年在我国辽宁丹东首次被发现[2]，随后逐渐向全国扩散，严重影响了我国玉米的生产，特别是对东北、华北和西南三大玉米主产区构成巨大威胁[3]。研究表明，控制灰斑病最经济有效且环保的方法是使用抗性品种[4-7]，而选育抗病品种的基础是筛选抗病资源。徐秀德等[8]利用人工接种的方法对20份玉米自交系进行灰斑病抗性鉴定，获得3份高抗自交系，5份抗病自交系。赵子麒等[9]利用田间自然鉴定方法，对48份玉米自交系进行抗灰斑病鉴定，筛选出10份抗灰斑病自交系。这些研究均为玉米自交系灰斑病抗性鉴定提供了参考。

为进一步了解玉米抗灰斑病特性，宋茂兴等[10]以高抗灰斑病自交系齐319和高感自交系掖478构建300个重组自交系(RIL)群体，结合199个SSR标记构建遗传图谱，根据2年人工接种鉴定，在染色体bin 1.02位置发掘了一个玉米抗灰斑病候选基因KHB5，两端标记分别为umc 2614和bnlg 1803，结合抗性鉴定结果，通过T检验证明了该标记能够对玉米灰斑病抗性进行有效的选择。李春红[11]利用高抗自交系T 32和高感自交系交51构建BC3F2近等基因系群体和包含180个单株的BC3F2-Micro小群体，将主效QTL-GLS8精细定位在标记ym 20～ym 51间，并利用BC3F2和BC3F2-Micro群体的交换单株验证了定位分析结果。王平喜[12]利用元分析方法整合了65个抗玉米灰斑病QTL，获得了11个“一致性”QTL区间。Sun等[13]以WGR为供体亲本，郑58、昌7-2为轮回亲本构建RILS群体，利用分子标记辅助选择技术成功将玉米抗灰斑病主效QTL位点qRgls1.06导入轮回亲本中，从而提高了郑58、昌7-2对玉米灰斑病的抗性。这些研究均为玉米抗灰斑病种质的分子鉴定提供了可能。

本试验以26份玉米骨干自交系为试材，通过人工接种，参考已有报道结果，筛选与玉米抗灰斑病主效QTL(或基因)紧密连锁的分子标记，对供试材料进行灰斑病标记检测，以期为玉米抗灰斑病的分子育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

本研究选用26份不同血缘玉米供试材料，均为目前国内西南地区玉米育种中的骨干自交系，由贵州大学农学院玉米研究所提供(表1)。

表1 26份供试材料Table 1 Twenty-six tested materials

1.2 人工接种鉴定

四川省农业科学院植物保护研究所是西南地区国家玉米区试抗病鉴定指定单位。本实验供试材料灰斑病抗性人工接种鉴定由该单位在成都新都玉米试验基地完成，方法参照《玉米抗病虫性鉴定技术规范第11部分：灰斑病》(NY/T 1248.11-2016)，以玉米自交系齐319为抗病对照，自交系掖478为感病对照，对供试材料进行玉米灰斑病抗性鉴定。

1.3 分子标记

根据www.maizegdb.org网站和已报道的文献，综合考虑表型贡献率，筛选与玉米抗灰斑病主效QTL(或基因)紧密连锁的6个分子标记(表2)，以齐319(高抗)为温带材料对照，以T 32(高抗)为热带材料对照，对供试材料进行分子标记检测。

表2 分子标记信息Table 2 Information of molecular markers

1.4 DNA提取、PCR扩增 及检测

参考卢振宇等[15]改良的CTAB法提取样品DNA，用超微量紫外分光光度计(Nano Drop One，Thermo，USA)检测DNA浓度与质量，稀释至15 ng/μL，在-20 ℃下保存。所用标记引物的序列均由上海生工生物工程公司合成。PCR反应体系10 μL：DNA模板3 μL，正、反向引物各0.6 μL(5 μmol/L)，10×Buffer 1 μL，MgCl2(25 mmol/L)1 μL，dNTP 0.75 μL(2 mmol/L)，Taq酶0.075 μL(5 U/μL)，Glycerol(99%)1 μL，ddH2O 1.975 μL。PCR反应在BIO-RAD C 1000 Thermal Cycler仪(ABI，USA)上进行。PCR扩增程序：93 ℃预变性1 min；93 ℃变性1 min，58 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对PCR产物进行检测。

注：1为高抗；3为抗病；5为中抗；7为感病；9为高感。图1 部分玉米自交系抗性表现Fig.1 Resistance performance of some maize inbred lines

1.5 统计分析

在玉米乳熟后期，参考国家标准(NY/T 1248.11-2016)抗性等级确定方法，对玉米自交系进行灰斑病抗病评价，评价标准为：1级高抗(HR)，穗位叶及上部3叶无病斑或有零星病斑，占叶面积0～5%；3级抗病(R)，穗位叶及上部3叶有少量病斑，占叶面积6%～10%；5级中抗(MR)，穗位叶及上部3叶有较多病斑，占叶面积11%～30%；7级感病(S)，穗位叶及上部3叶有大量病斑，病斑相连，占叶面积31%～70%；9级高感(HS)，穗位叶及上部3叶基本为病斑覆盖，叶片枯死。

2 结果与分析

2.1 自交系抗性分析

根据《玉米抗病虫性鉴定技术规范第11部分：灰斑病》(NY/T 1248.11-2016)，高抗对照齐319病级达1级，感病对照掖478病级达7级及以上，鉴定视为有效。本试验表明，自交系齐319病级为1级，自交系掖478病级达到9级(图1)，说明本次鉴定结果可靠。26份玉米自交系中，表现为高抗的自交系有4份，分别是齐319、苏65、GD 927和T 32，占所有供试材料的15.38%；抗病自交系3份，分别为QR 273、GH 35和SD 375，占11.54%；中抗自交系8份，分别为S 906、S 908、S 909、S 911、905 m、QB 446、昌7-2和掖107，占30.77%；感病自交系7份，分别为P 138、QB 1064、986、m 6323、A 1164、R 1164和郑58；占26.92%；高感自交系4份，分别为PH 4 CV、掖478、B 73和交51，占所有供试材料的15.38%(表3)；其中，15份中抗及以上的材料中有9份为热带血缘。结果表明，不同来源玉米自交系对灰斑病的抗性存在明显差异，抗病材料中热带材料偏多。

表3 玉米自交系抗灰斑病鉴定结果Table 3 Identification results of resistance to gray leaf spot in maize inbred lines

注：1为齐319;2为苏65;3为GD 927;4为T 32;5为QR 273;6为GH 35;7为SD 375;8为S 906;9为S 908;10为S 909; 11为S 911;12为905 m;13为QB 446;14为昌7-2;15为P 138;16为QB 1064;17为986;18为PH 4 CV;19为掖107;20为m 6323;21为A 1164;22为R 1164;23为郑58;24为掖478;25为B 73;26为交51。 图2 分子标记在26份材料中扩增结果 Fig.2 Amplified results of 26 materials by molecular markers

2.2 主效QTL位点的检测

为了解供试材料灰斑病主效抗病位点，利用6个与玉米抗灰斑病主效QTL(或基因)连锁的分子标记，对26份供试材料进行分子标记检测(图2)。结果表明，26份供试材料在6个标记位点带型不尽相同，与高抗自交系齐319带型一致的材料主要集中在KHB5和qRgls2.04两个位点，分别有11份(苏65、GD 927、QR 273、GH 35、SD 375、S 906、S 908、S 909、S 911、905 m、掖107)和9份(苏65、GD 927、QR 273、S 906、S 909、S 911、905 m、昌7-2、掖107)。与高抗自交系T 32带型一致的材料主要集中在qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02三个位点，分别有10份(苏65、GD 927、QR 273、S 906、S 908、S 909、S 911、905 m、QB 446、掖107)、8份(GD 927、GH 35、SD 375、S 906、S 908、S 909、S 911、掖107)和10份(GD 927、QR 273、GH 35、SD 375、S 906、S 908、S 909、S 911、QB 446、昌7-2)。表明不同来源玉米材料其灰斑病抗病位点有所不同，主要集中在KHB5、qRgls2.04、qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02等5个抗病位点。

2.3 接种鉴定和标记检测结果一致性分析

为进一步了解人工接种鉴定和标记检测结果的一致性，对接种鉴定表现为中抗及以上的15份材料进行带型统计。结果表明，在KHB5和qRgls2.04位点，与齐319带型一致的分别有11份和9份，分别占所有中抗及以上材料的73.33%和60%；在qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02位点，与T 32带型一致的分别有10、8份和10份，分别占所有中抗及以上材料的66.67%、53.33%和66.67%(表4)。结果表明，在KHB5和qRgls2.04位点，分子标记umc 2614和TID 5306可以检测与齐319(高抗)一致的抗病位点。在qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02位点， umc 1972、umc 1042和bnlg 1523可以检测与T 32(高抗)一致的抗病位点(图3)。

表4 抗病材料分子标记检测结果Table 4 Testing results of molecular markers for resistant materials

图3 抗病材料在齐319与T 32间的分布Fig.3 The distribution of disease-resistant materials between Qi 319 and T 32

3 结论与讨论

本研究利用人工接种的方式对26份玉米骨干自交系进行灰斑病抗性鉴定。同时，利用灰斑病主效QTL(或基因)连锁的6个分子标记，进行抗病位点的检测。经接种鉴定，表现为中抗以上级别的材料有15份，其中高抗有4份。分子标记检测结果表明，供试材料抗病位点主要集中在KHB5、qRgls2.04、qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02等5个位点。umc 2614和TID 5306可以检测与齐319(高抗)一致的抗病位点(KHB5和qRgls2.04)，umc 1972、umc 1042和bnlg 1523可以检测与T 32(高抗)一致的抗病位点(qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02)，且接种鉴定与分子标记检测结果总体一致，研究结果可为玉米分子育种提供参考。

为筛选玉米抗灰斑病材料，吴纪昌等[16]利用人工接种的方法对915份玉米自交系进行灰斑病抗性鉴定，获得157份抗性材料，这些材料多数都具有热带或亚热带血缘。吕国忠等[3]利用人工接种法，对28份玉米自交系进行灰斑病的抗性鉴定和评价，筛选出7份抗病自交系，且都具有热带血缘。本研究利用人工接种法对26份玉米自交系进行灰斑病抗性鉴定，获得的15份中抗及以上材料中，有9份材料如苏65、GD 927、T 32和S 906等都具有热带血缘，与前人研究结果一致。说明在抗灰斑病种质改良创新中，具有热带或亚热带血缘的种质可作为基础材料。

玉米对灰斑病的抗性主要表现为加性遗传效应，属数量性状遗传[17]。史利玉[18]以161份玉米自交系为材料，采用全基因组分布的4 110个SNP标记对玉米抗灰斑病进行关联分析，结合基于双亲作图群体定位的42个QTL，确定了3个抗灰斑病候选基因GLScgb03071、GLScgb03072和GLScgcb0907。宋军锋等[19]运用KASP分子标记和QTL作图策略，对抗灰斑病自交系K 22的抗性进行QTL定位，检测出3个QTL区间bin 1.09、2.04和7.0，并在3个区间内搜索到2个可能与K 22高抗灰斑病密切相关的基因Zm00001d033217和Zm00001d021947，进一步证明玉米灰斑病抗性是由多个基因控制的数量性状。本研究中，自交系GD 927、S 906、S 908、S 909和S 911既在KHB5和qRgls2.04抗病位点与温带材料齐319带型一致，又在qRgls1.06、qRgls2.07和qRgls3.02抗病位点与热带材料T 32带型一致，表明GD 927、S 906和S 908等热带种质不但具有与温带种质齐319一致的抗病位点，也具有与热带种质T 32一致的抗病位点。因此，结合温带和热带材料抗病主效位点连锁的分子标记，能有效的对玉米种质灰斑病的抗性进行检测。