参苓白术散对NAFLD大鼠肝细胞PTEN和PI3Kp85α mRNA及其蛋白表达的影响

★ 陆雪萍 黄进 韦静 梁新安 方显利 韦芳芳（广西医科大学附属武鸣医院 南宁 530199）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）又称为非酒精性脂肪肝，是指除酒精和其他明确因素引起的，以肝实质细胞变性坏死、炎性细胞浸润、脂肪贮积等为主要特征的综合性代谢应激性肝脏损伤［1］。NAFLD包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及非酒精性脂肪性肝炎相关性肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌［2］。研究表明，NAFLD属遗传-环境-代谢相关性疾病，其临床表现除肝功能异常及因疾病发展而表现出的相应症状体征之外，还存在如肥胖、高血压、高血糖、高血脂等代谢异常情况［3-4］。目前，NAFLD发病率增长迅速且呈低龄化发展趋势，是全球最常见的慢性肝病，严重危害人类健康［5-7］，已成为肝病组织及相关学者研究和防治的热点。磷酸酶张力蛋白同系物（phosphoatase and tensin homolog，PTEN）是迄今发现的第一个具有双重磷酸酶活性的抑癌基因，是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）介导的信号转导通路的关键负反馈调节子，PTEN 水平下降会导致肝脂质蓄积，PI3K则介导着机体营养代谢、细胞生长、增值、凋亡等，两者在NAFLD 的发生和发展中起着重要作用［8-11］。本实验通过高脂饮食诱导建立NAFLD大鼠模型，观察参苓白术散对NAFLD大鼠肝细胞PTEN和PI3Kp85α mRNA及其蛋白表达的影响，以阐释参苓白术散对NAFLD大鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±20）g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2013-0002，常规饲养1周后，将大鼠随机分为4组，即正常组、模型组、健脾低剂量组和健脾高剂量组，每组15只。

1.2 实验用药与配置

参苓白术散（广东一方制药有限公司中药配方颗粒剂）：人参15 g，茯苓15 g，白扁豆12 g，薏苡仁9 g，白术15 g，砂仁6 g，莲子9 g，山药15 g，桔梗6 g，炙甘草9 g。低剂量为人临床等效剂量，将药物溶于300 mL温开水中；高剂量为人临床等效剂量的3倍用量，将药物溶于100 mL温开水中。

1.3 主要试剂

Quant cDNA第一链合成试剂盒购自北京天根生化科技有限公司（货号：KR103-04）；Real Time PCR荧光定量试剂盒购自Gene Copoeia公司（货号：QP051）；ACTB购自Cloud-Clone Corp公司（货号：CAB340Mi22）；PTEN Antibody购自北京博奥森生物技术有限公司（货号：Bsm-33319M）；PI3Kp85α Antibody购自南京建成生物生物工程研究所（货号：KF650）；胎牛血清购自Corning Cellgro公司（货号：35-081-CV）；IV型胶原酶购自广州美仑生物科技有限公司（货号：MB2711）；细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司（货号：P8370）。

1.4 模型建立

除正常组大鼠给予基础饲料喂养外，其他3组均以高脂饲料（以基础饲料88%，猪油10%，胆固醇1.5%，胆盐0.5%配置而成）喂养造模。在施以造模因素的同时，按10mL/（kg·bw），健脾低剂量组和健脾高剂量组大鼠予以参苓白术散灌服，正常组和模型组大鼠灌予以蒸馏水灌服，每日1次，连续12周。

1.5 实验取材与检测

治疗12周后，每组随机取9只大鼠腹腔麻醉，开腹心脏采血约6 mL制备血清；取相同部位的肝组织，-80 ℃低温冰箱保存备用。各组余下6只大鼠腹腔麻醉后剖腹，游离门静脉主干并插管固定，迅速注入肝素钠溶液抗凝，采用离体循环灌注Ⅳ型胶原酶，离心后选择性贴壁分离肝细胞，并通过流式细胞术鉴定肝细胞纯度。

1.5.1 肝组织病理观察取距离肝缘1.5 cm处相同部位的肝右叶组织（0.5 cm×0.5 cm）投入分装好的10%的甲醛溶液中，作常规HE染色，光镜下观察肝组织病理变化。

1.5.2 血脂的检测采用全自动生化分析仪对血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等生化指标进行测定。

1.5.3 Real Time Q-PCR检测基因表达水平参照Trizo操作说明书提取肝细胞总RNA，进行纯度鉴定后，逆转录为cDNA。大鼠PTEN、PI3Kp85α和内参ACTB的cDNA序列通过GeneBank查找。PTEN上游引物5'-GCGTGCGGATAATGACAAGG-3' ，下游引物5'-TGGAGAGAAGTATCGGTTGGC-3'；PI3Kp85α上游引物5'-ACAAAGCCGAGAACCTATTGC-3'，下游引物5'-TGACTTCGCCATCTACCACTAC-3'；ACTB上游引物5'-TCAGCAAGCAGGAGTACGATG-3'，下游引物5'-GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACA-3'。参照PCR试剂盒说明，采用20 μL反应体系，95 ℃预变性1 min，变性95℃ 10 s，ACTB 57.5 ℃、PTEN 58 ℃、PI3Kp85α 60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，扩增40个循环。反应完毕，采用Opticon Monitor 3.1软件分析结果。

1.5.4 Western blot分析肝细胞PTEN和PI3Kp85α蛋白表达水平按6×106将计数分离的肝细胞加入1 mL RIPA裂解液中匀浆裂解30 min后移至EP 管离心5 min，取上清液BCA法测定总蛋白浓度，计算含50 μg蛋白的溶液上样，经15% SDS-PAGE电泳分离后将蛋白转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBS-T漂洗PVDF膜3次每次5 min，分别用对应辣根过氧化物酶标记二抗（1∶3000），室温孵育2 h，取出PVDF膜，TBS-T漂洗3次每次5 min，洗去未结合的二抗，曝光、显影、定影。Western blot结果使用光密度测量计扫描，进行灰度值比较。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对数据进行分析，服从正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，并采用单因素方差分析进行组间比较。方差齐时选择SNK法进行组间两两比较，方差不齐时选择Tamhane's T2法检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肝组织病理形态学结果

正常组大鼠肝细胞结构完整，无气泡。模型组大鼠肝细胞肿胀，细胞浆呈空泡状。观察组大鼠肝组织结构介于正常组与模型组之间，且健脾高剂量组大鼠肝组织结构与正常组更为相似。见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理形态学变化（HE染色×400）

2.2 血脂

模型组与正常组比较，大鼠血清TC、TG 、LDL-C含量显著升高（P＜0.01），HDL-C含量显著降低（P＜0.01）；观察组与模型组比较，大鼠血清TC、TG、LDL-C含量降低（P＜0.05），以健脾高剂量组表现更为显著（P＜0.05），HDL-C含量显著升高（P＜0.05）；健脾高剂量组大鼠血清TC、TG含量低于健脾低剂量组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血脂比较（±s，n=9） mmol/L

表1 各组大鼠血脂比较（±s，n=9） mmol/L

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与健脾低剂量组比较，**P＜0.05。

组别 TC TG HDL-C LDL-C正常组 1.16±0.31 0.29±0.04 1.42±0.35 0.49±0.13模型组 3.57±0.82* 0.54±0.11* 1.03±0.23* 2.07±0.68*健脾低剂量组 2.95±0.63# 0.43±0.07# 1.25±0.28# 1.54±0.53#健脾高剂量组 2.16±0.82##**0.37±0.05##**1.38±0.31## 1.38±0.44#

2.3 FCM鉴定肝细胞

低浓度标记峰标志R2的平行线起点左侧为阴性细胞，起点右侧移位红色峰代表阳性细胞，蓝色峰则为IgG阴性对照峰。CK-18抗体检测肝细胞：在检测的1×104个细胞中有9 273个细胞表达为CK-18，所占比为92.73%，即肝细胞纯度为92.73%。见图2。

图2 FCM鉴定肝细胞纯度

2.4 肝细胞PTEN和PI3Kp85αmRNA表达

模型组与正常组比较，大鼠肝细胞PTEN mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），PI3Kp85α mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；观察组与模型组比较，大鼠肝细胞PTEN mRNA表达水平升高（P＜0.05），PI3Kp85α mRNA表达水平降低（P＜0.05），以健脾高剂量组表现更为显著（P＜0.01）；健脾高剂量组大鼠肝细胞PTEN mRNA表达水平较健脾低剂量组升高（P＜0.05），PI3Kp85αmRNA表达水平较健脾低剂量组降低（P＜0.05）。见表2。

表2 肝细胞PTEN和PI3Kp85α mRNA相对表达量（±s，n=6）

表2 肝细胞PTEN和PI3Kp85α mRNA相对表达量（±s，n=6）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与健脾低剂量组比较，**P＜0.05。

组别 PTEN PI3Kp85α正常组 0.98±0.29 1.15±0.76模型组 0.32±0.11* 6.47±1.73*健脾低剂量组 0.51±0.23# 4.29±1.58#健脾高剂量组 0.79±0.25##** 2.71±1.32##**

2.5 肝细胞PTEN和PI3Kp85α蛋白表达

模型组与正常组比较，肝细胞PTEN蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），PI3Kp85α蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；观察组与模型组比较，大鼠肝细胞PTEN蛋白表达水平升高（P＜0.05），以健脾高剂量组表现最为显著（P＜0.01）；且健脾高剂量组大鼠PI3Kp85α蛋白表达水平较模型组降低（P＜0.05）；健脾高剂量组大鼠肝细胞PTEN蛋白表达水平较健脾低剂量组高（P＜0.05），PI3Kp85α蛋白表达水平较健脾低剂量组低（P＜0.05）。见图3和表3。

表3 肝细胞PTEN和PI3Kp85α蛋白表达水平比较（±s，n=6）

表3 肝细胞PTEN和PI3Kp85α蛋白表达水平比较（±s，n=6）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与健脾低剂量组比较，**P＜0.05。

组别 PTEN PI3Kp85α正常组 0.63±0.18 0.37±0.12模型组 0.18±0.07* 1.14±0.58*健脾低剂量组 0.33±0.12# 0.99±0.37健脾高剂量组 0.48±0.14##** 0.54±0.20#**

图3 肝细胞PTEN和PI3Kp85α 蛋白表达水平

3 讨论

中医理论认为，NAFLD的发生是脾虚湿盛，痰瘀互阻，积渐而成。NAFLD初期治疗以疏肝理气、健脾和胃为主；中后期以健脾益肾、化瘀散结为主，健脾法贯穿NAFLD 治疗的始终［12-13］。参苓白术散出自我国历史上第一部由官方主持编撰的成药典《太平惠民和剂局方》，是健脾益气，利水渗湿的经典方剂。本团队前期的临床研究表明，参苓白术散可改善NAFLD患者的症状、体征，具有护肝、改善血脂异常及减轻肝脏脂肪变性等作用［14］，但其具体的作用机制尚未明确。

PTEN所编码的PTEN蛋白具有强大的磷酸酶活性，可通过其脂质磷酸酶、蛋白磷酸酶及其不依赖于磷酸酶的生物活性，影响肝细胞胰岛素敏感性及糖代谢［15］。NAFLD与肥胖及糖尿病密切相关，目前“二次打击”理论认为，NAFLD的发展包括两个阶段，第一次打击胰岛素抵抗是引起NAFLD的关键致病因子，第二次打击涉及脂肪组织分泌的游离脂肪酸、脂肪因子等多因素的共同参与［16-18］。Sun H J等［19］研究发现，特异性敲除肝脏PTEN和SAV1双基因可加速小鼠NAFLD的发病。Han J等［20］研究表明，高脂饲料喂养的小鼠PTEN表达显著降低。同时，静脉注射PTEN抑制剂可以诱导小鼠肝纤维化，提示PTEN在NAFLD的纤维化过程中起重要作用。PI3K是由调节亚基（p85）和催化亚基（p110）组成的异源二聚体。其中p110亚基又可被细分为3种（p110α、p110β和p110δ），而p85亚基则可被分为五种（p85α、p85β、p55γ、p55α和p50α）。在众多亚基中，p85α调节亚基和p110α催化亚基最为重要，对于这两种亚基的研究也最为清楚。过度表达p85亚基能够竞争性抑制p85-p110二聚体与胰岛素体底物1（IRS-1）的结合，从而抑制PI3K的活性［21-22］。研究表明，抑制PI3Kp85α蛋白的表达，可显著改善NAFLD大鼠胰岛素抵抗，降低血脂、肝功及改善肝组织病理［23］。

本研究通过喂养高脂饲料成功建立了NAFLD大鼠模型，模型组较正常组比较，大鼠TC、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量降低，肝细胞PTEN mRNA及其蛋白表达水平降低，PI3Kp85α mRNA及其蛋白表达水平升高，提示NAFLD的发生发展可能与PTEN mRNA及其蛋白表达水平下调及PI3Kp85α mRNA及其蛋白表达水平上调有关。进一步推测PTEN/PI3Kp85α信号通路激活，可上调TC、TG合成，过多的脂质沉积于脏脏导致NAFLD的形成。

同时，本研究对NAFLD大鼠分别给予高剂量和低剂量参苓白术散治疗，结果显示参苓白术散可改善NAFLD大鼠肝组织病理变化，降低NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL-C含量，提高血清HDL-C含量，不同程度升高NAFLD大鼠肝细胞PTEN mRNA及其蛋白表达水平，降低PI3Kp85α mRNA及其蛋白表达水平，以高剂量参苓白术散的效果最为显著，提示PTEN/PI3Kp85α信号通路可能是参苓白术散抗NAFLD的有效作用靶点。本研究揭示，参苓白术散可能是通过抑制NAFLD大鼠肝细胞PTEN/PI3Kp85α信号通路激活，使TC、TG合成减少，发挥防治NAFLD的药理作用。