儿童结肠息肉中NLRP3、miR-22-3p表达及对疾病进展的影响*

郭小刚， 罗培燕， 彭 雷

(重庆市黔江中心医院 普外科， 重庆 409000)

儿童结肠息肉临床常表现为间歇性无痛性鲜血样便，疾病原因是结肠黏膜表面隆起并向肠内突起[1-2]。研究显示结肠息肉的进展与结肠癌的发生发展有关，息肉病变类型中腺瘤性息肉更易发生癌变[3]。因此，探寻结肠息肉疾病进展中相关生物标志物以监测癌变发生风险，对于阻断和预防结肠癌发生有重要临床价值。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是体内固有免疫的组分，在炎症反应中有重要作用[4]。李潇等[5]研究显示，NLRP3在溃疡型结肠炎患者结肠组织中高表达。微小RNA-22-3p(microRNA-22-3p，miR-22-3p)与结直肠癌细胞增殖、迁移等密切相关[6]。应用生物信息学软件预测发现，NLRP3与miR-22-3p间存在靶向调控作用[7]，但二者在儿童结肠息肉中的作用仍缺乏研究。因此，本研究旨在探究NLRP3及miR-22-3p在结肠息肉疾病进展中的表达分析儿童结肠息肉疾病进展中的影响因素，为监测结肠息肉疾病进展提供可靠的临床生物学指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1对象 选取2019年11月—2021年5月住院治疗的98例结肠息肉患儿，3～12岁，其中幼年性息肉52例、腺瘤性息肉46例，另选取相对应患儿正常结肠组织作为对照，收集整理98例患儿性别、年龄、息肉部位、息肉数目、黏膜状态及息肉直径等临床资料。纳入标准：(1)结肠息肉经内镜及病理检查确诊；(2)组织标本完整、且临床资料齐全；(3)入组前未进行过术前治疗，研究经医院临床研究伦理委员会批准，患儿或家属均自愿参加。排除标准：(1)有先天性肠管畸形或家族性息肉病者；(2)哭闹严重、不能配合完成实验者；(3)有肠道恶性肿瘤或其他部位恶性肿瘤者；(4)有肝肾功能不全者。

1.1.2主要试剂与仪器 免疫组化试剂盒(货号XY--0022)购自上海信裕生物科技有限公司，NLRP3抗体(货号FNab10120)购自武汉菲恩生物科技有限公司，miRNA提取试剂盒(货号AM1556)购自美国Life公司，miRNA反转录试剂盒(货号D1802)购自海基生物科技有限公司，SYBR Green RT-PCR Master Mix(货号HY-K0521)购自美国MedChemExpress公司，光学显微镜(型号CX23)购自日本OLYMPUS公司，qRT-PCR仪(型号CFX96)购自美国Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1样品采集及保存 采集结肠息肉患儿术中正常结肠组织以及息肉组织、腺瘤性息肉组织，液氮保存待测。

1.2.2miR-22-3p表达水平检测 按照试剂盒操作说明提取组织总RNA并合成cDNA，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-22-3p相对表达量，引物序列见表1。反应总体积为20 μL：cDNA模板(50 mg/L)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBR Green RT-PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O 8.0 μL，重复3次。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法(CT代表循环阈值)计算目的基因miR-22-3p的相对表达量。根据98例结肠息肉患儿miR-22-3p相对表达量中位值(0.48)，将其分为miR-22-3p高表达49例、miR-22-3p低表达49例。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primers of qRT-PCR

1.2.3NLRP3蛋白水平测定 对各组织标本进行处理(采用40 g/L多聚甲醛固定、脱水、透明、石蜡包埋、连续切片)后，按试剂盒操作说明进行免疫组化染色(PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照)，之后每张切片随机选5个视野(10×40倍)观察，并计数200个细胞，由3名人员独立采用半定量法评判。首先按照阳性细胞所占百分比计分，阳性细胞比例1/3以下计1分、1/3～2/3计2分、2/3以上计3分；然后按染色强度计分，棕褐色计3分、棕黄色计2分、浅黄色计1分、无着色计0分；两次评分乘积为最终得分，≤2分为阴性表达、>2分为阳性表达。根据98例结肠息肉患儿NLRP3蛋白表达情况，将其分为NLRP3阴性表达38例、NLRP3阳性表达60例。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 NLRP3阳性表达和miR-22-3p相对表达量

与正常结肠组织比较，幼年性息肉组织、腺瘤性息肉组织中NLRP3阳性表达率逐渐升高，miR-22-3p相对表达量逐渐降低，各组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表2 NLRP3阳性表达和miR-22-3p相对表达量Tab.2 Comparison of NLRP3 positive expression and relative expression of miR-22-3p

注： A为正常结肠组织，B为幼年性息肉组织，C为腺瘤性息肉组织。图1 各组组织中的NLRP3蛋白阳性表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.1 Positive expression of NLRP3 protein in the tissues of each group(immunohistochemical method,×400)

2.2 不同临床病理特征结肠息肉组织中NLRP3、miR-22-3p表达

不同性别、年龄、息肉部位、黏膜状态患儿结肠息肉组织中NLRP3、miR-22-3p表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；腺瘤性息肉、息肉多发、息肉直径≥2.5 cm的结肠息肉患儿中NLRP3阳性表达、miR-22-3p低表达的比例逐渐升高(P<0.05)。见表3。

表3 不同临床病理特征结肠息肉组织中NLRP3、miR-22-3p表达[n(%)]Tab.3 Expression of NLRP3 and miR-22-3p in CP with different clinicopathological features[n(%)]

2.3 儿童结肠息肉发展为腺瘤性的单因素和多因素分析

以儿童结肠息肉是否发展为腺瘤性作为因变量，以性别、年龄、息肉部位、息肉数目、黏膜状态、息肉直径、NLRP3、miR-22-3p为自变量进行单因素Logistic回归分析，再以单因素分析中有统计学意义的息肉数目、息肉直径、NLRP3、miR-22-3p为自变量进行多因素Logistic回归分析。结果显示，NLRP3是影响结肠息肉发展为腺瘤性的独立危险因素(P<0.05)，miR-22-3p是影响结肠息肉发展为腺瘤性的保护因素(P<0.05)。见表4、表5。

表4 儿童结肠息肉发展为腺瘤性的单因素分析Tab.4 Univariate analysis of adenomatous CP in children

表5 儿童结肠息肉发展为腺瘤性的多因素分析Tab.5 Multivariate analysis of adenomatous CP in children

3 讨论

结肠息肉是儿童肠道常见病，主要由黏膜过度生长所致，其发展过程中极易恶变[8]。结肠息肉发病机制目前尚不清楚，可能与环境、遗传、基因异常表达等因素有关[9-10]。结肠息肉早期时息肉直径较小，临床症状缺乏特异性，极易被忽视，使得部分患者就诊时已发展为腺瘤，或已出现癌变[11-12]。因此，寻找与结肠息肉发展过程相关的生物标志物，已成为目前的研究热点。研究表明，结肠黏膜长期的炎性刺激是结肠息肉公认的病因之一[13]。NLRP蛋白家族作为炎性小体的关键组成部分，其在纤维化、肿瘤及炎症等发生发展中有重要作用[14-15]。NLRP3受高血糖、游离脂肪酸、低密度脂蛋白等多种激活因素刺激和调节，其激活后可诱导多种炎性因子的成熟及分泌，引发组织损伤及炎症级联反应[16]。miR-22-3p是哺乳动物中常见的miRNA之一，广泛表达于各类细胞和组织中，可通过与靶基因3′非编码区特异结合，导致靶基因沉默、抑制蛋白质表达等，进而在疾病的发生发展中发挥重要作用[17-18]。Wang等[19]研究结果显示，miR-22-3p通过靶向NLRP3抑制尿酸单钠诱导的痛风性炎症。Hu等[20]研究中miR-22-3p通过靶向NLRP3对视网膜色素上皮炎性损伤发挥保护作用。而本研究结果同样显示结肠息肉组织中NLRP3与miR-22-3p存在负相关，与既往研究文献以及生物信息学软件预测结果一致。此外，本研究结果中NLRP3及miR-22-3p在结肠息肉组织中分别表达上调和下调，腺瘤性息肉、息肉多发、息肉直径≥2.5 cm的结肠息肉患儿中NLRP3阳性表达、miR-22-3p低表达的比例较高，且二者均是结肠息肉疾病进展的影响因素。王洪等[21]研究结果表明，NLRP3的异常表达将引发免疫紊乱，刺激炎性因子的释放，减弱肠道免疫应答，引发炎症性肠病。结合NLRP3与miR-22-3p间的调控关系结果及既往文献中NLRP3在儿童炎症性肠病免疫机制中的作用，推测儿童正常结肠组织在炎症等作用下出现结肠息肉，miR-22-3p在病理作用下表达水平降低，miR-22-3p负调控NLRP3使其蛋白表达升高，NLRP3作为免疫应答的重要组成部分，其异常高表达会进一步引发免疫紊乱，造成肠道微生态菌群发生改变，诱导多种炎性因子的成熟和分泌，引发炎症级联反应，使肠道免疫应答减弱，而结肠粘膜在炎症的反复刺激下发生腺瘤性病变。

综上所述，正常结肠组织、幼年性息肉组织、腺瘤性息肉组织中NLRP3阳性表达率逐渐升高、miR-22-3p相对表达量逐渐下调，且二者均是结肠息肉疾病进展的影响因素。NLRP3及miR-22-3p有望成为监测结肠息肉癌变的重要生物学指标，同时本研究为进一步探索新的治疗靶标提供依据。然而NLRP3及miR-22-3p参与结肠息肉疾病进展的机制有待进一步探究，样本量需进一步扩大。