天麻素对神经母细胞瘤细胞突触相关蛋白表达的影响*

江沂， 刘燕娣， 刘婉， 陈海敏

(广州医科大学附属中医医院 病理科， 广东 广州 510130)

阿尔茨海默氏病(alzheimer’s disease，AD)是老年性痴呆最常见类型之一，以认知和记忆功能进行性减退为主要临床特征，其主要病理特征包括细胞外β淀粉样蛋白(β amyloid protein, Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque, SP)、细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)及脑萎缩[1]。Aβ的聚集是AD发生和发展的核心因素，可直接或间接破坏突触的结构和功能，引起突触功能障碍和突触丢失[2-3]。突触正常功能的发挥及可塑性的维持与突触相关蛋白密切相关，已知突触相关蛋白主要有突触素(synapsin, SYN)、突触后致密蛋白95(postsynaptic density of 95, PSD95)、发动蛋白1(dynamin, DYN1)等[4]。天麻(gastrodiae rhizome, GR)是我国珍贵的药食同源中药，天麻素(gastrodin, GAS)、香荚兰醇(vanillyl alcohol)、香荚兰醛(vanillin)是其有效化学成分，大约在两千多年前就被神农草药经典所记载，具有脑神经保护作用。有关GAS的研究表明，其药理效应众多，包括增强认知功能、抗炎、抗氧化、抗抑郁和抗焦虑等，且无其它不良反应[5-6]。本研究以人神经母细胞瘤(neuroblastoma cell, SH-SY5Y)细胞为研究对象，采用安全浓度的GAS单独或联合Aβ1-42处理，观察处理后突触相关蛋白SYN、DYN1及PSD95 mRNA及蛋白表达改变，探讨GAS对神经细胞突触蛋白水平的影响及其神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

GAS购买自贵州益康制药有限公司，经鉴定符合企业内控标准；SH-SY5Y细胞购于德国German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司，鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体、HRP标记的抗兔、抗鼠二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology Inc公司。兔抗Synaptophysin多克隆抗体(ab32594)购自美国Abcam公司；兔抗PSD95多克隆抗体(GTX133091)、兔抗DYN1多克隆抗体(GTX110379)购自美国Gene Tex公司；SYN、DYN1、PSD95及β-actin的引物均由上海生物工程有限公司设计并合成。

1.2 研究方法

1.2.1Aβ寡聚体的制备[7]将0.1 mg的Aβ1-42溶于220 μL的六氟异丙醇 (hexafluoroisopropanol, HFIP)，使其浓度为0.1 mmol/L，混匀、室温放置1 h后，冰上放置10 min，分装于1.5 mL的 Epp 管中，通风橱过夜，Epp 管底部可见白色的薄膜，放置-80 ℃备用。细胞处理前，溶于二甲基亚砜 (DMSO) 中，使其终浓度为 5 mmol/L，用改良的 Dulbecco Eagle 培养基稀释， 4 ℃下孵育24 h后处理细胞。

1.2.2CCK8法筛选GAS安全浓度 为筛选GAS处理SH-SY5Y细胞的安全浓度，选择0、25、50、75、100、125、150、175及200 μmol/L GAS处理SH-SY5Y 细胞24 h，采用CCK8方法检测细胞活力，观察GAS对细胞的毒性作用，筛选GAS安全浓度。

1.2.3细胞分组及药物干预 取4 ℃下孵育 24 h后的SH-SY5Y细胞分为对照组(不经处理SH-SY5Y细胞，再培养48 h)、Aβ组(经5 μmol/L Aβ1-42寡聚体处理48 h)、GAS组(加入50、85及120 μmol/L的GAS 培养48 h)及Aβ+GAS组(先加入85 μmol/L GAS 预培养24 h 后，再按照Aβ组方法处理细胞)。

1.2.4SYN、DYN-1、PSD-95 mRNA水平 参照文献方法[8]， 采用Trizol一步法提取细胞总 RNA，逆转录合成cDNA， 再以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。SYN、DYN-1、PSD-95及β-actin的引物序列见表1。运用ABI 7500型实时荧光定量PCR仪，采集基因扩增各循环的荧光信号，以Applied Biosystems SDS 2.1软件收集荧光并分析数据。以β-actin为内对照，计算各基因在实验组与对照组的相对水平(RQ=2-ΔΔCt)。实验重复3次，每次3个复孔。

1.2.5SYN、DYN1及PSD95蛋白水平 参考文献[8]提取细胞总蛋白，采用Western blot方法检测各组细胞突触相关蛋白SYN、DYN1及PSD95的表达水平。用Bandscan 软件以β- actin 蛋白条带作为内参照进行结果分析，以各蛋白与β-actin 蛋白条带像素灰度的百分比值作为SYN、DYN1及PSD95蛋白表达的相对水平。

表1 荧光定量PCR引物序列及产物片段Tab.1 Primer sequence and product fragment of quantitative fluorescence PCR

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 GAS安全作用浓度

如图1所示，GAS浓度≥150 μmol/L时，SH-SY5Y细胞活力开始出现下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明>150μmol/L时的GAS对细胞增殖能力有一定影响;0～150 μmol/L GAS范围时细胞活力无明显变化，表明在这一浓度范围内对细胞活力影响较小，可作为GAS处理细胞的安全浓度。

图1 GAS安全作用浓度筛选Fig.1 Concentration screening of GAS safety action

2.2 GAS对细胞突触相关蛋白mRNA及蛋白表达水平的影响

选用50、85及120 μmol/L的GAS分别处理SH-SY5Y细胞24 h，提取细胞总蛋白，测定突触相关蛋白SYN、DYN1及PSD95 mRNA及蛋白表达水平。结果提示随着GAS处理浓度的升高，SH-SY5Y细胞的SYN、DYN1及PSD95 mRNA及蛋白水平均上调(P<0.05)，并随着GAS浓度的升高而升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为细胞突触相关蛋白mRNA表达，B、C为细胞突触相关蛋白表达；与对照组比较，(1)P<0.05，(2) P<0.01。图2 GAS对SH-SY5Y细胞PSD95、SYN及DYN-1水平的影响Fig.2 Effects of GAS on the levels of PSD95, SYN, and DYN-1 in SH-SY5Y cells

2.3 GAS对抗Aβ 对细胞触相关蛋白mRNA及蛋白表达水平的影响

如图3所示，与对照组比较，5 μmol/L Aβ1-42处理细胞后引起SYN、DYN1、PSD95 mRNA及蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；说明Aβ通过降低突触蛋白水平发挥其毒性作用；用85 μmol/L GAS处理细胞后，与Aβ组比较，Aβ+GAS组细胞SYN、DYN1、PSD95 mRNA及蛋白表达水平明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)；说明GAS可减弱Aβ1-42对细胞突触相关蛋白的下调作用。

注：A为细胞突触相关蛋白mRNA表达，B、C为细胞突触相关蛋白表达；(1)与对照组比较， P<0.01;与Aβ 组比较，(2) P<0.05，(3) P<0.01。图3 GAS对抗Aβ对SH-SY5Y细胞突触相关蛋白表达的影响Fig.3 Effects of GAS against Aβ on the expression of synapse-related proteins in SH-SY5Y cells

3 讨论

AD 是一种常见的神经退行性疾病，其主要特征是认知功能缓慢性进行性丧失，临床表现为进行性记忆力降低，社会交往和适应能力降低，性格和精神异常[9]。Aβ 在细胞外沉积形成的老年斑是AD 的主要病理特征之一，在 AD 的发病中一直被认为起着重要的作用[10]，有研究证实Aβ 神经毒性作用及在 AD 发病中的重要作用，进一步研究Aβ 毒性作用的机制，可为 AD 治疗提供靶点依据；寻找到能有效对抗其神经毒性作用，具有神经保护作用的药物也是研究的重点。

突触是神经元之间信息主要通过突触传递，中枢神经系统突触结构和功能的改变与认知功能的降低关系密切，而且其改变早于广泛的神经元变性[11]。研究表明，海马神经元的突触可塑性变化以及突触丢失在AD的早期病理过程中占据着重要地位，与 AD 学习和记忆功能障碍密切相关[12]。Aβ 寡聚体聚集及其神经毒性刺激引起的突触功能损伤和数量减少与 AD 病程进展紧密相关[13]，因此寻找对抗Aβ突触毒性作用的药物可能在AD的治疗中起着重要作用[14]。SYN和PSD95 是突触的特异性标志物，在维持突触正常功能和可塑性方面具有重要作用，其表达下降意味着突触的丢失[15]。有研究显示，AD患者认知功能下降与突触囊泡回收蛋白表达异常有关。网格蛋白(clathrin)介导的内吞过程构成了突触囊泡的循环回收，多种蛋白参与其中共同协调完成，DYN1便是其中之一，参与到网格蛋白介导的突触囊泡的内吞过程。有研究表明随着APP/PS1双转基因小鼠月龄的增加，Aβ的沉积增多，海马神经细胞突触蛋白水平明显降低，且与 APP/PS1转基因小鼠学习记忆障碍密切相关，说明Aβ可能通过降低细胞突触蛋白的水平来发挥其神经毒性作用[16]。

GAS是GR中活性成分含量最高的有效单体成分，具有包括抗炎、抗氧化应激、抗焦虑等多种药理学作用。有学者采用最大耐受量 (MTD) 试验观察GAS软胶囊的亚急性毒性和急性毒性，在小鼠各脏器中均未检测到明显的病理学改变，表明GAS软胶囊在用药过程中不会产生明显毒副作用[17-18]。同时GAS也是一种强抗氧化剂，可降低细胞脂质过氧化水平，提高抗氧化蛋白表达[19]。也有研究表明GAS可以明显改善 AD 动物模型学习记忆障碍[20]，说明GAS具有增强认知能力的作用。而突触蛋白水平与学习记忆障碍密切相关，GAS改善学习记忆功能障碍的作用是否与其调控突触相关蛋白的表达值得进一步研究。本研究发现，GAS在高浓度使用时对细胞均无明显毒性作用，说明其安全性较好，这与其他研究一致[5-6]。本研究还发现，Aβ1-42能够明显降低SH-SY5Y细胞突触相关蛋白 SYN、DYN1及 PSD95 mRNA 及蛋白的表达水平，提示GAS能够明显地上调 SYN、DYN1及 PSD95 表达水平，并能对抗Aβ1-42寡聚体所导致这3种突触相关蛋白表达的降低，进一步提示GAS可以通过上调突触蛋白表达的作用来改善学习记忆功能，可能在 AD 的治疗中具有重要的作用，值得进一步开发研究。

综上所述，GAS具有上调SYN、DYN1及PSD95 表达的作用，在安全浓度范围内呈剂量依赖性关系; 天麻素在细胞整体水平有抗Aβ 的神经细胞毒性作用，其作用机制可能与其对抗Aβ 引起的突触相关蛋白表达降低有关，可能在AD 的中药治疗中发挥重要作用。