氧糖剥夺再灌注后BV2细胞中差异表达关键基因的筛选及鉴定*

郭冬芬， 任真奎， 安小琼， 陈明， 孙嫚彬，吴昌学*， 禹文峰*

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 3.贵州省第二人民医院 检验科， 贵州 贵阳 550004； 4.贵州医科大学 儿科系， 贵州 贵阳 550004)

脑卒中是造成成人残疾与死亡的主要疾病之一，目前临床仍然没有良好的预防与治疗方案[1-2]，也没有比较明确的早期辅助检测的诊断指标。转录测序是对生物基因在转录水平表达进行的大规模检测，可揭示生物在转录水平发生的差异表达。生物信息学作为一门新生学科，因为其拥有的强大数据支撑及复杂算法，近年来被广泛运用于临床医学及基础医学的数据分析中[3]。对转录测序结果进行生物信息学分析，能在一定置信度下缩小分析范围，更精准地找到研究目标。近年来，利用转录测序结合生物信息学分析，试图寻找诊断、预后和治疗脑卒中标志物，已然成为研究热点[4-6]。有研究对脑缺血再灌注小鼠脑组织进行转录测序，并通过生物信息学分析预测，发现巨噬细胞在脑缺血再灌注后的神经血管重塑中发挥重要作用[7]；而对脑缺血再灌注小鼠骨骼肌进行转录测序，结果显示脑缺血性卒中小鼠模型中与蛋白水解和神经肌肉连接相关基因表达发生显著变化[8]；提示即使同样是脑缺血再灌注小鼠模型，但因研究的侧重点不同，也可能会得到不同的研究发现。因此本次实验选取小鼠小胶质细胞BV2进行氧糖剥夺再灌注处理，并结合生物信息学分析，希望找出因氧糖剥夺再灌注诱导的差异表达较大的基因，以期筛选出新的分子靶点，为脑卒中的研究提供新的研究思路及方向。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、主要试剂与仪器

小鼠小胶质细胞BV2购于中科院上海细胞库。引物序列购于上海生工，cDNA逆转试剂盒购于Takara公司，实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)相关试剂购于Genstar，dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)完全培养基、无糖培养基及胎牛血清购于Gibico，实时荧光定量检测仪器(Biorad)，-80 ℃冰箱(中国HAIER)，核酸定量仪(Thermo Fish Scientific)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养与分组 BV2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，培养条件为5%CO2、37 ℃，为正常组(control组)。待细胞密度生长至70%～80%，根据实验需要选择继续传代培养或用于实验种板；将生长状况良好的BV2细胞用胰酶消化后，1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀用培养基重悬并进行细胞计数；细胞悬液按(5～6)×107个/ L接种于6孔板中，待其密度生长至50%～60%时，将培养基更换为无糖培养基，置于5% CO2、94%N2、37 ℃恒温培养箱中培养4 h，随后用磷酸盐缓冲液轻柔洗涤3次，将培养基更换为完全培养基，培养条件为5%CO2、37 ℃，继续培养24 h，即为氧糖剥夺再灌注组(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R组)。

1.2.2差异基因筛选及功能、通路富集分析 对转录数据进行分析处理，限定条件为log2(fold change)≤-5、或log2(fold change)≤5，P≤0.01，筛选出差异表达基因。在线网站(https://www.xiantao.love/products)对差异表达基因进行基因本体论(gene ontology, GO；包括细胞组成成分、分子功能以及生物功能分析)以及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。

1.2.3蛋白质互作网络分析 为了进一步了解差异表达基因的分子间相互作用，在线网站String(https://cn.string-db.org/)对差异表达基因进行蛋白质互作网络分析，cytoHubba插件对蛋白互作分析结果进一步处理，筛选出在OGD/R组中评分较高的10个关键基因。

1.2.410个关键基因的mRNA表达检测 qRT- PCR检测经cytoHubba插件筛选出的10个基因的mRNA表达水平。用TRIZOL分别提取control组、OGD/R组的总RNA并测定核酸浓度，取0.5～1 μg RNA按试剂盒说明书进行cDNA的合成。得到的cDNA冻存于-80 ℃冰箱或用于后续的实时荧光定量实验。进行qRT- PCR时，按照试剂盒操作方案进行模板、上下游引物、SYBR混合体系的配制，然后按照以下条件上机循环扩增：95 ℃ 2 min，95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39个循环；95 ℃ 5 s完成反应。引物序列见表1，以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算该10个关键基因的相对表达。

1.3 统计学分析

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 结果

2.1 OGD/R诱导基因差异表达

control组和OGD/R组的转录组测序结果显示，共检测出22 621个基因，见图1A。相较于control组，OGD/R组筛选出122个基因发生差异表达(P<0.01)，其中有108个基因表达上调，有14个基因表达下调，见图1B。

注：A为转录测序结果分析热图，B为差异基因火山图。图1 差异表达基因筛选Fig.1 Screening of differential expressed genes

2.2 差异表达基因的功能富集分析

GO分析结果显示122个差异表达基因主要与受体配体激活、静脉曲张、正调控STAT信号通路具有重要相关性(图2A)。KEGG分析结果显示，差异表达基因主要富集到白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)信号通路中(图2A)。在线网站String对122个差异表达基因进行蛋白质网络互作分析(图2B)，cytoscope插件对差异表达基因进行分析计算 ，筛选出其中10个评分较高的关键基因(图2C)，包括IL-6、粒细胞集落刺激因子(colony stimulating factor 3,Csf3)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(colony stimulating factor 2,Csf2)、Cd40 抗原(Cd40 antigen,Cd40)、IL-1β、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)、丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂B分支成员2(serine/cysteine peptidase inhibitor, clade B, member 2,Serpinb2)、IL-10、CXC基序趋化因子配体2 [chemokine (C-X-C motif) ligand2,Cxcl2]以及IL-12b。

注：A为GO和KEGG分析结果，B为蛋白质互作网络分析结果，C为cytoHubba(插件)筛选结果。图2 差异表达基因的功能富集分析Fig.2 Gene function enrichment analysis

2.3 qRT-PCR验证差异表达的基因

qRT-PCR结果显示，与control组比较，OGD/R组IL-6、IL-1β、Csf2以及Serpinb2 mRNA表达增加(图3A)，IL-10、IL-12b、Cd40、Csf3、Cxcl2以及Ptgs2 mRNA表达降低(图3B)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

脑卒中主要分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占所有脑卒中类型的80%[9- 10]，且具有高致残、高致死、高复发的特点[11]，目前临床用于治疗脑卒中的主要方法是静

注：A为OGD/R组表达上调的基因，B为OGD/R组表达下调的基因；与control组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。图3 10个关键基因的mRNA表达水平Fig.3 mRNA expression level of 10 key genes

脉溶栓[12-13]和血栓取出术[14-15]，但这些治疗方案仍面临着多方面的问题。因而，继续探索脑卒中的发病机制，寻找新的分子靶点对于治疗脑卒中仍然具有重要意义。转录测序结合生物信息学分析能在具有一定可信度的条件下找到新的分子靶点，近年来在基础医学及临床医学被广泛运用[16-19]，通过对脑梗组和正常组进行转录测序并对其进行分析、验证，试图寻找脑卒中相关分子靶点[20-21]。

因此，本研究通过对control组及OGD/R组细胞进行转录组测序，对转录数据进行分析，发现相较于control，OGD/R组中存在大量差异表达的基因，其中表达差异大于五倍且具有统计学意义的基因有122个。针对这122个基因，进行了更近一步的GO、KEGG以及蛋白质网络互作分析，最后筛选出122个差异表达基因中10个评分较高的基因。并且qRT-PCR结果显示，促炎因子IL-6和IL-1βmRNA表达上调，抗炎因子IL-10 mRNA表达下调，表明OGD/R模型的建立成功[22-23]。Csf是一种集落刺激因子，其中Csf2为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，参与调控细胞的生存和增殖，在炎症部位，它能通过募集髓样细胞并增强其存活和活化而发挥促炎作用[24]。OGD/R处理后Csf2表达增加，参与OGD/R诱导的炎症反应的放大，而Csf3表达发生下调。除此之外，qRT-PCR结果还显示，Serpinb2 mRNA表达在OGD/R组发生明显增加。有研究发现，在受到炎症刺激时Serpinb2表达会明显增加[25]。但是，同时Cd40、Ptgs2、Cxcl2、IL-12bmRNA表达发生下调。猜测这可能是由于细胞存在的自我调节作用，由于其他炎性指标增加，细胞为了避免炎症反应的过度放大，保持动态平衡，从而促进以上几个炎性因子的表达下调，但这其中的机制还需要更进一步的探索表明。

综上所述，本研究发现OGD/R处理会诱导大量基因差异表达，通过对转录测序结果进行分析可筛选出关键基因，进一步的qRT-PCR验证发现关键基因发生差异表达，这对于进一步探索脑卒中发病机制研究具有指示意义。