闽东野生金线莲无菌体系建立与优化研究

施满容 罗义发

摘要 [目的]研究闽东野生金线莲无菌体系建立的最佳培养基配方。[方法]以闽东野生金线莲茎段为试材，通过正交试验得到无菌的诱导芽体，通过萌发的芽体增殖建立金线莲的无菌培养体系，筛选出闽东野生金线莲快繁的最佳培养基配方。[结果]闽东野生金线莲茎段诱导芽体萌发最适培养基配方为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，与其他配方之间具有极显著差异;芽继代增殖培养基配方为MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，且与其他处理间差异极显著。[结论]诱导芽时应适当提高一定范围内细胞分裂素类浓度;芽增殖时应适当降低细胞分裂素浓度，细胞分裂素与生长素比值为10倍时有利于芽增殖生长。

关键词 野生金线莲;无菌体系;闽东

中图分类号 S567.23  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）07-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.022

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Establishment and Optimization of the Sterile System of Wild Aoectochilus roxburghii from Eastern Fujian Province

SHI Man-rong， LUO Yi-fa

（Ningde Vocational College， Fuan， Fujian 355000）

Abstract [Objective] To select the most suitable formula for the cultivation of bud inductions for Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province. [Method]The orthogonal experiment utilized the stem of wild Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province as object to obtain sterile bud inductions， which composed the sterile cultivating system through multiplying and figured out the formula of Aoectochilus formosanus that facilitated its generation. [Result]The most suitable formula for the cultivation of bud inductions for Aoectochilus formosanus from eastern Fujian Province was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，which was significantly different from other treatments;multiplying formula for the subculture of the succession was MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L， which was significantly different from other treatments. [Conclusion] Concentration of cytokinins was expected to be raised in certain range during bud inductions;concentration of cytokinins need to be deduced in bud cultivation， and the bud tend to multiply when cytokinins was 10 times higher than auxin.

Key words Wild Aoectochilus formosanus;Sterile system;Eastern Fujian Province

金線莲是兰科开唇兰属多年生草本植物，具有药用、保健和观赏多重价值。金线莲喜阴凉、潮湿的环境，要求温度20～25 ℃，忌阳光直射，主要生长在常绿阔叶林、毛竹林、竹阔混生林下的沟边、石壁、土质疏松的潮湿地带。由于金线莲种子没有胚乳，只有在真菌共生下，才能促进种子萌发，因此发芽率很低，难以满足市场需求，组织培养已成为主要繁殖手段。

目前国内许多学者从多个方面对金线莲组织培养技术进行了研究，郝丽丽等[1]以金线莲茎尖外植体诱导的腋芽为试材，探讨6-苄氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、玉米素（ZT）和激动素（KT）对金线莲腋芽增殖的影响;黄勇[2]以滇越金线莲和花叶开唇兰2个金线莲品种果实为外植体进行组织培养，建立并优化了金线莲组织培养体系;黄碧华[3]以优良观赏金线莲茎段、茎尖、叶片为试材，研究其再生植株在不同外源激素配比下的适宜培养基;刘伟等[4]以金线莲组培苗的茎段和顶芽为外植体进行增殖培养，比较不同基本培养基、细胞分裂素、生长素、添加物等因素对金线莲生长状况的影响，筛选最佳增殖培养基;刘润东等[5]以福建罗源县野生金线莲为外植体，进行芽丛诱导、继代培养、芽分化和根诱导试验，结果表明，MS基本培养基中附加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L和ZT 0.02 mg/L，芽丛的诱导率最高可达9592%;王雅英等[6]以试管苗带节茎段和顶芽为外植体，用正交试验筛选芽快速增殖的培养基配方;黄淑燕等[7]以福建永安、广西玉林、台湾南投不同产地金线莲幼嫩茎段为外植体诱导丛生芽，通过不同培养基配方的筛选，建立不同产地金线莲组培快繁体系;何碧珠等[8]以福建省福州市及三明市金线莲茎段为试验材料，诱导愈伤组织和原球茎，建立金线莲的无菌培养体系;杨红丽等[9]以云南金线莲茎段为外植体，研究不同的消毒方法和激素水平对组织培养的影响，筛选出合适的培养基配方;陆素君[10]以广西野生金线莲茎段为材料进行研究试验;汪佳秀等[11]以江西野生金线莲茎段为外植体，分析茎段不同位置、培养基、生长调节剂和添加物对不定芽增殖和幼苗生长的影响，建立金线莲无菌繁殖体系。目前，有关福建闽东野生金线莲组培快繁体系建立的研究仍较少。笔者以闽东野生金线莲茎段为外植体，采用6-BA、NAA、KT 3因素3水平正交试验筛选最佳芽诱导培养基配方，通过不同激素配比研究对其芽增殖的影响，从而建立无菌快繁体系，旨在为加快闽东金线莲快繁产业发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以从福建省福安市社口镇采集的野生金线莲植株茎段为外植体材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的处理。将金线莲植株用自来水冲洗干净后去除根、叶，在超净工作台上先用75%乙醇浸泡30 s，再用01% HgCl加1滴吐温消毒液浸泡10 min，无菌水冲洗3～5遍至无泡沫。用消毒滤纸吸干表面水分，切除伤口部分约05 cm，再切成带有1节1芽约1.0 cm的茎段，平放接种到不同诱导培养基上，进行芽丛诱导。

1.2.2 芽诱导。以MS为基础培养基，进行3因素3水平正交试验L 9（34）设计（表1），3次重复。每处理接种10瓶，每瓶接种3个茎段，各处理培养基均加入蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，香蕉汁100 g/L，pH调至5.8～6.0，培养30 d后统计芽体诱导率（诱导率=诱导芽的外植体数/接种外植体数×100%）。根据结果筛选最佳芽诱导培养方案。培养室温度（25±2） ℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间12 h/d。

1.2.3 继代增殖培养。以最佳培养方案进行诱导所得的芽体作为中间繁殖体，转接到不同增殖培养基中培养，每瓶接种3个芽体，每种培养基接种10瓶，重复3次。各处理培养基均加入蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，香蕉汁100 g/L，pH调至5.8～6.0。接种后置于培养室中进行增殖培养，培养30 d后，观察外植体芽体增殖情况及长势，确定最佳增殖培养方案。增殖倍数=总芽数/接种数。

1.3 统计分析

应用SPSS 22.0数据分析软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂配比对芽诱导的影响

金线莲无菌茎段经30 d培养后，统计萌芽数和诱导率情况，结果见表2。由表2可知，9种培养基均能诱导金线莲外植体，其中处理⑤诱导率最高，达96.7%;处理⑦芽诱导率最低，仅600%。试验结果表明：

2.0、3.0、4.0 mg/L 6-BA浓度配比下的诱导率分别为78.9%、84.4%、63.3%，说明芽诱导率随着6-BA浓度的升高先增大后下降，6-BA浓度太高反而不利于芽诱导。1.5、1.0、0.5 mg/L KT浓度配比的诱导率分别为78.9%、75.6%、72.2%，说明芽诱导率随着KT浓度的升高而增大。0.1、0.2、0.3 mg/L NAA浓度配比下的诱导率分别为67.8%、82.2%、76.7%，说明芽诱导率随着NAA浓度的升高先增大后下降。试验结果表明芽诱导最佳配方是MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L。SPSS数据分析结果表明，处理⑤与其他8个处理差异达到极显著水平。表2结果表明，3种生长调节剂对芽诱导培养影响表现为6-BA>NAA>KT。

2.2 不同植物生长调节剂配比对芽体增殖的影响

金线莲腋芽接种10 d后，基部腋芽开始突出并明显增长，30 d后出现大小各异、数目不等的增殖腋芽，继代增殖结果见表3。由表3可知，金线莲腋芽增殖培养最佳培养基为MS+ 6-BA 20 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，获得芽数最多为33个，增殖系数最大，为3.3。SPSS数据分析结果表明，处理①与各组之间差异极显著。

试验结果表明，在不同配比的培养基组合中，当NAA、KT浓度相同时，较低浓度6-BA对芽体的增殖起促进作用，随着6-BA浓度上升，增殖系数反而下降。说明培养基中NAA、KT浓度不变时，只有适量的6-BA浓度才能达到最佳增殖效果。当6-BA浓度保持不变，只变化NAA浓度时，处理1、处理5、处理8增殖倍数相对高于另外2组，说明6-BA与NAA比值大约控制在10倍左右，增殖效果最好。芽体增殖后不转移继续培养可以长出不定根，直接成苗。

3 讨论与小结

在金線莲培养过程中，影响腋芽诱导和增殖的一个关键因素是培养基中激素浓度的配比。6-BA、NAA和KT是组织培养快速繁殖的3种常用生长调节剂，其使用浓度对芽诱导和增殖的影响很大。刘润东等[5]对福建省罗源县采集的野生金线莲研究结果表明，激素组合6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L能诱导芽丛的发生，随着6-BA和NAA浓度的升高则不利于芽丛的诱导;当6-BA浓度最高为5.0 mg/L、NAA为0.5 mg/L时，诱导材料几乎全部坏死。何碧珠等[8]研究表明，福建省福州市及三明市金线莲茎段出芽率随着6-BA浓度的升高先增大后减小，说明茎段诱导芽体的培养基中6-BA的浓度不宜过高。黄淑燕等[7]研究表明，6-BA浓度对不同产地金线莲作用效果不同，福建永安金线莲对6-BA的浓度要求低，而广西玉林金线莲对6-BA浓度要求最高。该研究表明，当6-BA增加到4.0 mg/L时诱导率均下降，与以上学者的研究基本一致。通过正交试验筛选出金线莲腋芽诱导的最适培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.5 mg/L，培养30 d后芽诱导率达到96.7%。正交试验中3种植物生长调节剂对芽诱导的影响表现为6-BA>NAA>KT，这与王雅英等[6]的研究结果一致。

植物组织培养过程中，以芽繁芽的途径来增殖，遗传性稳定，是最广泛应用的途径之一。该试验筛选出最佳增殖培养基配方是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L，经30 d培养增殖系数达到3.3。当保持NAA 0.2 mg/L不变，6-BA增加到3.0 mg/L时，6-BA/NAA达到15倍时增殖系数为2.6，6-BA增加到4.0 mg/L，6-BA/NAA达到20倍时，增殖倍数仅为1.6。当NAA 0.3 mg/L时，表现为随着6-BA浓度升高增殖系数下降;当NAA 0.5 mg/L时，则表现为随着6-BA浓度升高增殖倍数下降，说明6-BA/NAA比值高不利芽增殖生长，这可能与金线莲芽体对6-BA有一定的忍耐力有关，在初代培养中芽体中已经积累了一定浓度6-BA，增殖培养时6-BA浓度高反而抑制芽的再分化增殖生长。说明培养基中NAA、KT浓度不变，6-BA浓度过高反而达不到理想的效果，只有适量才能达到最佳增殖效果。这与黄淑燕等[7]的研究结果基本一致，但与何碧珠等[8]的研究结果（NAA浓度一定时芽体的增殖速度随着6-BA浓度的升高先增加后下降）不一致，这可能与金线莲产地、培养条件等有关。

在组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例决定器官分化，即脱分化时生长素低，细胞分裂素高;再分化时生长素高，细胞分裂低素。该研究结果表明，闽东野生金线莲茎段脱分化诱导芽时，适当提高细胞分裂素浓度有利于芽诱导;芽增殖时应适当降低细胞分裂素浓度，当细胞分裂素与生长素比值为10倍时，有利于芽增殖生长。

参考文献

[1] 郝丽丽，乙引，申刚，等.金线莲腋芽增殖培养条件的优化[J].贵州农业科学，2010，38（7）：18-19.

[2] 黄勇.金线莲组织培养新体系建立及优化[J].北方园艺，2010（13）：178-179.

[3] 黄碧华.观赏金线莲组培快繁技术研究[J].林业勘察设计，2009（2）：85-88.

[4] 刘伟，王牛柱.金线莲组织培养增殖培养基的筛选[J].安徽农业科学，2009，37（4）：1475-1476.

[5] 刘润东，郭文杰，林忠宁，等.金线莲组织培养及营养成分的分析研究[J].广西农业科学，2006，37（5）：506-509.

[6] 王雅英，林荣耀，杨忠耿，等.金线莲快速繁殖及促根壮苗试验[J].亚热带植物科学，2005，34（3）：40-42.

[7] 黄淑燕，荣俊冬，郑郁善.不同产地金线莲组培快繁试验[J].西南林业大学学报，2014，34（5）：64-68.

[8] 何碧珠，何官榕，黄铭星，等.福建野生金线莲快速繁育技术[J].农业工程，2013，3（2）：72-76.

[9] 杨红丽，胡靖锋，徐学忠，等.金线莲的组织培养与快速繁殖研究[J].西南农业学报，2013，26（6）：2485-2488.

[10] 陆素君.金线莲茎段组织培养技术的研究[J].湖北林业科技，2016，45（3）：23-26.

[11] 汪佳秀，武艳艳，钟田坤.金线莲组织培养快繁技术试验[J].南方农业，2016，10（6）：50-52.