外周血循环肿瘤细胞检测在慢性阻塞性肺疾病患者肺癌筛查及预后判断中的价值*

和建武，郭春丽，程西安，罗 祥

陕西省铜川市人民医院呼吸内科，陕西铜川 727000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以气流受限、肺功能下降为主要特征的肺部疾病，一般气流阻塞呈现不完全可逆性、进展性发展，常发生于老年患者，具有较长的病程和较高的致残率、致死率[1-3]。该病病因较复杂，与颗粒物吸入、有毒气体吸入、肺部感染等有关，一般患者仅出现咳嗽、气短、多痰、喘息、肺啰音、继发性肺部感染等非特异性临床表现[4-5]。肺癌是临床中常见的恶性肿瘤之一，流行病学调查发现，近年来肺癌的发病率和病死率均呈现逐年递增的趋势，肺癌也是癌症主要死因，严重危害人类的健康和生命[6-8]。COPD患者的肺癌发病率高达16.7‰，且肺癌早期无明显症状，待出现明显症状后往往已处于晚期，严重影响患者的临床疗效和生命安全，因此，对COPD患者进行早期肺癌的筛查具有重要意义。外周血循环肿瘤细胞(CTCs)检测是一种抽取恶性肿瘤患者的外周血，检查肿瘤细胞的方法。恶性肿瘤发展的过程中，有可能通过血液传播出现转移，因此，外周血中可能存在肿瘤细胞，检测CTCs有利于肿瘤转移患者的诊断，并且对判断肿瘤的复发和转移都有帮助。CTCs检测方法为细胞计数法，包括免疫细胞化学法、流式细胞术及核酸检测法。本研究探讨了CTCs在COPD患者肺癌筛查及预后判断中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年6月至2017年9月本院收治的55例COPD合并肺癌患者纳入合并组，选择同期收治的60例单纯COPD患者纳入COPD组。所有患者均符合《慢性阻塞性肺疾病全球倡导(2017版)》[9]诊断标准，合并组患者均同时接受了支气管镜肺部活检、经皮穿刺肺活检、痰细胞检测、淋巴结活检。排除有严重肝肾功能障碍、循环系统紊乱、脑梗死、精神类疾病、认知功能障碍的患者，剔除临床病历资料不全及失访患者。所有患者均有咳嗽、多痰和喘息等一般性临床症状，25例(21.74%)出现胸痛症状(合并组17例，COPD组8例)，54例(46.96%)出现发热症状(合并组31例，COPD组23例)，42例(36.52%)出现痰中带血(合并组28例，COPD组14例)。经胸部X线片或CT检查，主要表现为局限性肺不张、阻塞性肺炎、片状阴影等。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。所有患者均自愿参与本研究，并签署了知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会审核批准(2021143)。

表1 两组一般资料比较

1.2仪器与试剂 免疫荧光显微镜、0.1%Triton X-100通透胞膜、肺腺癌A549细胞株(北京天沃科技发展有限公司)、鼠抗人细胞角蛋白(广谱)单克隆抗体(P-CK，上海田源生物技术有限公司)、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(北京索莱宝科技有限公司)、4%多聚甲醛、磷酸盐缓冲液、5%牛血清蛋白。

1.3方法

1.3.1CTCs检测 采集患者外周静脉血6 mL(舍去穿刺后前2 mL血液)，加入肝素后采用密度梯度离心法收集肿瘤细胞。分离环状乳白色单核细胞层，磷酸化，再次进行离心。将单个核细胞悬液均匀涂在载玻片上，室温静置30 min，4%多聚甲醛固定，10 min后以0.1%Triton X-100通透胞膜进行磷酸盐缓冲液冲洗(15 min)，以5%牛血清蛋白封闭， 采用P-CK和4,6-二脒基-2-苯基吲哚进行染色，在免疫荧光显微镜视野下观察细胞情况。

1.3.2CTCs阳性判定标准 细胞呈现椭圆、圆形或长形，细胞核质比明显大于血细胞，可同时被P-CK和4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，荧光下细胞形态完整，呈现蓝色和绿色荧光即判定为阳性。

1.3.3肿瘤分期 参照国际抗癌协会修订的《最新国际肺癌TNM分期诊断标准(第7版)》[10]标准对合并组患者肿瘤进行分期。

2 结 果

2.1两组患者CTCs阳性表达情况比较 COPD组患者的CTCs阳性表达率为0，合并组患者的CTCs阳性表达率为85.45%(47/55)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2各种检测方式对合并组患者肺癌确诊情况比较 合并组中，经支气管镜肺部活检诊断为肺癌患者37例(67.27%)，经皮穿刺肺活检诊断4例(7.27%)，痰细胞检测诊断6例(10.91%)，淋巴结活检诊断8例(14.55%)。各种方式的检出率均明显低于CTCs阳性表达率(85.45%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3不同特征COPD合并肺癌患者CTCs阳性表达情况比较 不同性别、年龄、病理分型COPD合并肺癌患者的CTCs阳性表达例数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但不同的TNM分期、远处转移情况COPD合并肺癌患者的CTCs阳性表达例数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同特征COPD合并肺癌患者CTCs阳性表达情况比较(n)

2.4不同CTCs表达情况患者预后情况比较 合并组中，CTCs阳性表达患者47例，平均生存周期为(7.36±1.85)个月，CTCs阴性表达患者8例，平均生存周期为(13.54±2.34)个月，差异有统计学意义(P<0.05)。CTCs整体阴性患者(COPD组60例与合并组中CTCs阴性表达患者8例)的平均生存周期为(20.76±4.24)个月，CTCs阳性表达COPD合并肺癌患者的平均生存周期也明显短于CTCs整体阴性患者，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

近年来，随着人口老龄化进程加快，人们生活及饮食习惯改变，以及环境的变化等因素影响，各类慢性疾病的患病率不断升高，COPD作为一种严重威胁患者生活质量、耗费医疗资源的肺部疾病，目前已成为临床上第三大致死疾病[11-13]。肺癌是起源于支气管黏膜或腺体癌变的恶性肿瘤，患者预后往往较差。有研究证实，肺癌与COPD的并发主要与患者存在吸烟史或有长期刺激性气体(颗粒物)暴露史等有关，也与COPD造成的肺纤维化和上皮组织过度增生、患者长期使用激素类药物等造成机体免疫抑制等有关[14-16]。临床发现，由于CT、X线片、组织活检等传统检测方式对肺癌早期检测具有一定的局限性，且其结果受到影像学检查医务工作人员或病理科医生的影响，加之肺癌早期不具有特异性表现，大多数COPD合并肺癌的患者在采用传统检测方法确诊时常为肺癌晚期，且因为COPD进展导致患者肺功能差,一般难以行手术治疗，使患者错过最佳治疗期，严重影响患者的预后[17-18]。因此，寻求一种特异度高的早期筛查肺癌手段具有重要临床意义。

CTCs是游离于外周血中所有肿瘤细胞的统称。研究证实，除了从已形成的实体瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落入血外，肿瘤细胞在形成实体瘤病灶之前便有可能进入血液系统中[19]，提示CTCs的存在往往要早于影像学表现或临床症状的出现。CTCs检测可以检测出已经进入血液循环系统的肿瘤细胞，且该技术对肿瘤特有的抗原、基因、蛋白等进行捕捉、判定，可检测出在血液中游离的肿瘤细胞究竟是哪个部位的，这意味着该技术能检测出游离在血液中所有种类的肿瘤细胞，对于肿瘤细胞的极早期筛查有不可忽视的作用。通过检查人血液中是否存在CTCs，可在肿瘤萌芽阶段就发现肿瘤，从而保证患者得到早期治疗，改善预后。

外周血CTCs检测与传统检测方法比较，是一种取材方便、对患者机体损伤小、特异度低、指标清晰的新型肿瘤检测方式。目前，已有研究发现外周血CTCs检测在肿瘤的临床诊断、病情监测、发现早期转移等方面具有重要意义，若CTCs阳性则提示患者预后差[19-20]。本研究结果也验证了上述研究结论，CTCs阳性表达的COPD合并肺癌患者的平均生存周期[(7.36±1.85)个月]短于CTCs阴性表达的COPD合并肺癌患者[(13.54±2.34)个月]，也明显短于CTCs整体阴性表达患者的平均生存周期[(20.76±4.24)个月]，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD组的CTCs阳性表达率为0，合并组的CTCs阳性表达率为85.45%，差异有统计学意义(P<0.05)。这提示COPD患者若出现CTCs阳性表达，患者有较大的概率并发肺癌，且患者的预后情况较差。本研究还发现，肿瘤分期Ⅳ期及有远处转移COPD合并肺癌患者的CTCs阳性表达例数明显多于肿瘤分期Ⅲ期及无远处转移COPD合并肺癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)，进一步表明CTCs可以提示患者的病情和预后情况。

综上所述，CTCs在对COPD患者肺癌筛查中可作为重要参考指标，且可反映患者远处转移情况，对患者病情评估和预后判断具有重要的指导意义，CTCs阳性表达提示患者预后较差。