11种杀菌剂对柑桔褐腐疫霉Phytophthora citrophthora的室内毒力

叶泉清，陈晶晶

(1 广西师范大学生命科学学院，广西桂林，541006；2 广西达庆生物科技有限公司，广西贵港，537300)

柑桔在栽培中常遭受疫霉菌侵害，引发脚腐病、褐腐病等病害。在不同地区，寄生柑桔的疫霉种类有所不同，造成的损害不同。有研究表明，柑桔褐腐疫霉Phytophthoracitrophthora分布广，寄主范围较宽，检出率高，是海南、广东湛江柑桔脚腐病的主要致病菌[1]，在四川该菌可引致柑桔脚腐病和根腐病[2-3]，在广东该菌是为害柑桔的主要疫霉种群[4]，也可造成贮藏柑桔果实腐烂[5]，可侵染幼苗导致柑桔苗疫病[6]，可侵染脐橙[7]、夏橙[8]、不知火杂柑[9]、温州蜜柑[10]、沙田柚等多种果实[11-13]造成果腐，近年该菌引发广西桂林部分柠檬园发生叶疫、果腐[14]。可以认为，该菌为害严重，在柑桔疫霉病害中的重要性较大。该菌为害潜育期短，病情发展快，例如，江西赣州脐橙果实发病后病斑在3～5 d达到果面1/3左右即落果[7]；以菌丝和厚垣孢子在病株或土壤里的残体上越冬，翌年菌丝生长并产生孢子囊释放游动孢子，随水流或雨水滴溅侵染叶片、果实，导致发病，潮湿、多雨天气有利于菌丝扩展和孢子囊形成，再侵染次数多，以致传播很快。生产上常用杀菌剂有甲霜灵、三乙膦酸铝、霜脲氰、烯酰吗啉、百菌清、代森锰锌及各种铜制剂等，这些药剂已经使用多年甚至30年以上。目前，杀菌剂对柑桔褐腐疫霉的室内毒力测定研究相对较少。甲霜灵属于苯基酰胺类的内吸杀菌剂，在防治卵菌病害上获得广泛的应用，但由于作用位点单一，病原菌容易产生抗药性。已报道有多种疫霉菌对甲霜灵产生抗性，导致防效下降[15]。因此，有必要监测柑桔疫霉病菌对甲霜灵等药剂的敏感性，并且筛选新的杀菌剂，以增加可供选用的药剂品种，减缓病原菌抗药性的产生。本研究选择具有不同作用机制的杀菌剂，对采集于桂林的柠檬褐腐病菌株进行了室内毒力测定，以期筛选出高效药剂，为病害的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株从广西桂林柠檬园采集患褐腐病的病果，经组织分离和纯化、形态学观察和分子生物学鉴定，确定获得的菌种为柑桔褐腐疫霉[14]。供试菌株由广西师范大学生命科学学院微生物实验室保存，将菌株转移至10%V8培养基斜面上，置于15 ℃恒温箱内备用，使用前先进行活化。

10%V8汁琼脂培养基(V8A)：将V8汁离心后取澄清液100 mL，CaCO30.2 g，琼脂20 g，加去离子水定容至1 L，121 ℃高压灭菌20 min。

1.2 供试药剂供试的11种杀菌剂分别为甲霜·锰锌、三乙膦酸铝、霜脲氰、烯酰吗啉、氟菌·霜霉威、双炔酰菌胺、氟噻唑吡乙酮、百菌清、代森锰锌、氢氧化铜、丁子香酚，各药剂的生产厂家、剂型、有效成分含量和毒力测试配制浓度见表1。

表1 供试药剂、生产厂家及毒力测试的浓度设置

1.3 试验方法采用菌丝生长速率法测定毒力。根据预试验结果，在无菌条件下，用无菌水配制供试药剂的母液并稀释成比设置浓度高10倍的系列母液，用移液枪量取药剂各浓度母液1 mL加入9 cm培养皿中，再分别加入灭菌并冷却至55 ℃左右的V8A 9 mL，混合摇匀，即制成系列质量浓度的含药培养基。供试柑桔褐腐疫霉菌活化后，接种在V8A上，25 ℃恒温箱培养4 d，用直径8 mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，菌丝面朝下接种到不同浓度的含药培养基上，每皿在中心放一块菌饼，每处理重复3次，以不加入药剂的V8A接种菌饼作为对照。接种后，置于25 ℃恒温箱中培养，4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100。

1.4 数据分析将菌丝生长抑制率换算成几率值，药剂有效成分浓度转换成浓度对数，用SPSS软件作统计分析，求出毒力回归方程、相关系数(r)和有效抑制中浓度(EC50)，评估杀菌剂的抑菌效果。

2 结果与分析

试验结果看出，各杀菌剂毒力回归方程的相关系数均在0.97以上，表明药剂浓度与抑制作用呈现较高的相关性。供试11种杀菌剂对柑桔褐腐疫霉菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用。其中，氟噻唑吡乙酮、双炔酰菌胺的抑制作用最强，EC50值很低，分别为0.000 6和0.011 6 mg/L；烯酰吗啉、氟菌·霜霉威和霜脲氰的抑菌作用比较好，EC50值均<1 mg/L，分别为0.464 8、0.608 8、0.647 1 mg/L；甲霜·锰锌的抑菌作用一般，EC50值为4.034 0 mg/L；代森锰锌、百菌清、三乙膦酸铝、氢氧化铜和丁子香酚的抑菌作用比较弱，EC50值分别为13.230 0、25.400 0、41.740 0、69.150 0和71.510 0 mg/L(见表2)。

3 讨论

疫霉菌在分类上属于卵菌，具有许多不同于真菌的特征，造成植物疫病较难防治。柑桔褐腐疫霉潜育期短，再侵染次数多，常引发柑桔苗疫病或褐腐病的暴发流行，化学防治仍然是控制病害的有效措施之一。目前，市场上防治疫病的杀菌剂主要针对番茄疫病、马铃薯晚疫病、烟草黑胫病和辣椒疫病等，因此，有必要筛选针对柑桔褐腐疫霉的有效防治药剂。本研究选用具有不同作用机制的11种杀菌剂，测定其对柑桔褐腐疫霉的室内毒力。结果表明，不同药剂对柑桔褐腐疫霉菌丝生长的抑制作用有明显差异，抑制作用最强的是氟噻唑吡乙酮和双炔酰菌胺，其次是烯酰吗啉、氟菌·霜霉威和霜脲氰，抑制作用一般的是甲霜·锰锌，抑制作用差的是代森锰锌、百菌清、三乙膦酸铝、氢氧化铜和丁子香酚。

用来防治柑桔褐腐疫霉病害的内吸性杀菌剂，早期药剂有甲霜灵、三乙膦酸铝和霜脲氰，后来增加了烯酰吗啉和嘧菌酯等。本测定结果反映出柑桔褐腐疫霉对甲霜灵、三乙膦酸铝的敏感性降低，而对霜脲氰、烯酰吗啉仍较为敏感。据报道，甲霜灵由于其作用位点单一，容易导致病菌产生抗药性，涉及的疫霉种包括柑桔褐腐疫霉；而霜脲氰的使用远不如甲霜灵面积广泛和时间长久，认为疫霉菌对霜脲氰产生抗性的风险较小[16]。烯酰吗啉属于羧酸酰胺类杀菌剂，与甲霜灵等苯酰胺类杀菌剂无交互抗性，成为继甲霜灵之后用于植物疫病防治的主要药剂，在治理柑桔褐腐疫霉对苯酰胺类杀菌剂的抗药性中起到了重要作用。羧酸酰胺类杀菌剂研发的突破性进展是开发出扁桃酰胺类杀菌剂双炔酰菌胺，于2007年投入市场。双炔酰菌胺与植物表面的蜡质层具有很高的亲合力，喷洒后大部分被吸附很难被雨水冲洗掉，渗透组织的活性成分足以抑制菌丝生长，具有稳定高效、持效期长的特征[17]。氟噻唑吡乙酮于2016年在我国正式登记，该药剂作用位点新颖，通过对氧化固醇结合蛋白的抑制达到杀菌效果，施药后可被植物蜡质层快速吸收，有效防止雨水冲刷，具有治疗和保护作用[18]。本研究中，氟噻唑吡乙酮和双炔酰菌胺的EC50值很小，对柑桔褐腐疫霉菌丝生长的抑制活性高，可作为防治首选用药。柑桔褐腐病受水分影响较大，降雨多，果园湿度大，病情发展快，而雨日多不利于用药防治，因而防治难度大；但上述两种药剂施治后具有耐雨水冲刷的特点，有助于在阴雨天气控制病情，提高防治效果。张培花等[13]研究了瑞丽市柚果疫病病原柑桔褐腐疫霉P.citrophthora对4种药剂各3个稀释浓度的敏感性，结果表明烯酰吗啉和甲霜灵·霜霉威的抑菌效果较好，而多宁可湿性粉剂几乎没有抑菌作用，后者属有机铜杀菌剂，结果与本研究相似。黄景龙等[19]开展了21种杀菌剂对柑桔脚腐病菌寄生疫霉P.parasitica的室内筛选，结果表明50%烯酰吗啉的毒力最强，EC50值为0.259 8 μg/mL，好于醚菌酯、代森锌、硫酸铜等。本研究中，烯酰吗啉对柑桔褐腐疫霉P.citrophthora的EC50值为 0.464 8mg/L。

尹敬芳等[20]测定了9种杀菌剂对辣椒疫霉P.capsici各生长阶段的抑制作用，结果表明烯酰吗啉对病菌的4个发育阶段(菌丝生长、孢子囊形成、游动孢子休止孢萌发、孢子囊直接萌发)均有显著抑制作用，而三乙膦酸铝的抑制作用较弱，百菌清、代森锰锌可抑制孢子囊形成、游动孢子休止孢萌发和孢子囊直接萌发，但对菌丝生长没有直接抑制作用。在本研究中，百菌清、代森锰锌和氢氧化铜对柑桔褐腐疫霉P.citrophthora菌丝生长的抑制效果也较差。

与辣椒疫霉P.capsici类似，柑桔褐腐疫霉不同发育阶段对不同药剂的敏感性也可能不同。因此，在柑桔苗疫、褐腐病发生的不同阶段应当选用不同的杀菌剂。在发病前或发病初期宜使用保护性杀菌剂，当侵染蔓延时使用活性高的内吸杀菌剂控制菌丝生长和扩展。同时，用药还要符合杀菌剂抗性治理策略，将不同作用机理或类型的药剂混用或轮换使用。例如，氟噻唑吡乙酮因作用位点单一具有中高水平抗性风险[18]，可与多作用位点的保护性杀菌剂代森锰锌混用，以延缓抗药性发生。一般果园在幼果发病或果实成熟期发现零星病果，遇雨天较多，应及时全园喷药，建议采用10%氟噻唑吡乙酮可分散油悬浮剂2 000～3 000倍液+80%代森锰锌500～800倍液，用药3次，间隔期7～10 d，视天气情况和发病程度而调整；对于往年病情较重的果园，重点对树冠中、下部果实及树冠下土壤表面进行喷药。除治疗用药外，也可以在较长时间的阴雨天气或台风雨前后喷药1～2次进行保护。双炔酰菌胺可作为氟噻唑吡乙酮的轮换药剂使用。柑桔苗圃发生苗疫病，在出现发病中心时须及时施药，所用药与上述褐腐病相似，采用淋浇苗地结合植株喷雾的方式施药。柑桔疫病的发生流行与环境条件、气候因素、栽培管理等密切相关，应实行综合防治。一些合理的管护措施，例如随时清理病果、防止低洼积水降低果园湿度、剪枝撑果改善果园通风透光等，可减轻发病或提升药剂施治效果。

本试验室内药剂筛选结果拓宽了防治柑桔苗疫、褐腐病的药剂选择范围，为田间药剂防治提供了理论依据，对防治柑桔脚腐病也有参考意义；药剂的有效性有待田间试验进行验证。