四川省某肉牛场犊牛呼吸道疾病的病原学诊断

岳 怡，岳 华，汤 承

（西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

牛呼吸道综合征（BRDC）是严重危害养牛业的一类疾病，发病率和死亡率都比较高，主要表现为发热、咳嗽、流鼻涕及呼吸困难等呼吸道症状。引起BRDC的病毒有牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛副流感3型病毒（BPIV-3）、牛腺病毒3型（BAV-3）等；引起BRDC 的细菌有多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、溶血性曼氏杆菌（M.haemolytica）、睡眠嗜组织菌（H.somni）；牛支原体（M.Bovis）也是引起BRDC的主要病原［1-2］。病毒感染是引起BRDC的重要原因，临床上不同地区引起BRDC 的病原种类可能存在差异，且常呈混合感染［3］。运输应激是BRDC 暴发的重要诱因，从异地引进牛群造成的运输应激，会使牛机体抵抗力降低，从而诱发本病［4］。

2021 年3 月四川某肉牛场犊牛暴发BRDC，这批犊牛为内蒙古引进的3～4 月龄西门塔尔牛犊牛，在引进的4 d后有28头犊牛出现体温升高、食欲减退、精神沉郁以及咳嗽、呼吸困难、流鼻涕等呼吸道临床症状。本试验的目的是对发病牛的临床样本进行常见呼吸道病原检测，为该场BRDC的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2021 年3 月于四川省某肉牛场采集了10 份3～4 月龄发病犊牛的深部鼻腔棉拭子。

1.2 主要试剂 TrizolTM试剂盒购自TaKaRa，T3 Super PCR Mix 购自擎科生物，反转录试剂盒购自成都蓉为生物，Marker DL2000 购自南京诺唯赞生物，核酸染料Golden View 购自西安赫特生物。

1.3 核酸提取 将采集的10 份鼻拭子样本，用PBS按1∶3的比例处理，充分混匀后，以8 000 r/min 4 ℃下离心10 min，取500 μL上清液于1.5 mL灭菌EP管中，每份样本取两管备用。

用Trizol 法提取10 份鼻拭子样本的总RNA，再反转录合成cDNA；用酚-氯仿抽提法提取10份鼻拭子样本的DNA。将DNA 和cDNA 放－20 ℃保存备用，RNA放－80 ℃保存备用。反转录体系：DEPC-treated Water 8 μL，5×Reaction Mix 4 μL，Supreme Enzyme Mix 3 μL，RNA 5 μL。反应条件：25 ℃10 min，55 ℃15 min，85 ℃5 min。

1.4 阳性cDNA BCoV、BVDV、IBRV、BAV-3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica及H.somni等病原的阳性cDNA均由西南民族大学动物医学实验室保存。

1.5 检测病原的PCR 方法 采用文献［5-8］报道的BCoV、BVDV、IBRV、BAV-3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica和H.somniPCR 检测方法对这10 个鼻拭子样本进行检测。所有引物均由上海生工合成，引物信息见表1。

表1 病原PCR检测引物信息

PCR 反应体系：T3 Super PCR Mix 17 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，总体积共20 μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35 个循环；72 ℃终延伸5 min；12 ℃保存。

2 结果

10 份鼻拭子样本的PCR 检测结果如下：BCoV 检出7 个阳性，阳性率为70%；BVDV 检出3 个阳性，阳性率为30%；其他病原未检出。详见图1 和图2。

图1 BCoV检测结果

图2 BVDV检测结果

3 讨论

3.1 BCoV 流行情况 BCoV 具有双噬性，即能感染上、下呼吸道和肠道，在临床上可以引起犊牛腹泻（CD）、成年牛冬季痢疾（WD）和牛呼吸道疾病综合征［11］。BCoV作为BRDC的重要病原体，近年来颇受关注，国外已有越来越多的证据表明BCoV 与BRDC相关。在国外，BCoV是导致BRDC 的常见病原，BCoV 在瑞士BRDC 牛群中的阳性率可达53.5%［12］。杨海峰等［13］对我国14 个省的176 份牛呼吸道样本进行病原学检测，结果检出BCoV 阳性率为21.59%；魏硕佟等［14］对宁夏地区186 份牛呼吸道样本进行病原学检测，结果检出BCoV 阳性率为16.67%。说明BCoV 引起的BRDC 在我国广泛流行。本试验对内蒙古犊牛鼻拭子的BCoV 检出率为70%，与流行病学调查结果一致。综上，对我国BCoV 在BRDC 中流行情况的调查和防控有必要进一步加强。

3.2 BVDV 流行情况 在国外，BVDV 也是导致BRDC 的常见病原之一。BVDV 在加拿大BRDC牛群中的阳性率高达69%［15］。我国对BVDV 的研究主要在于与牛腹泻的关系，但是该病毒还是引起肺炎和繁殖障碍的重要病因。本实验室曾于2019 年对四川省108 份牛呼吸道样本进行过病原学检测，结果检出BVDV 阳性率为16.7%［16］；魏硕佟等［14］于2021 年对宁夏地区186 份牛呼吸道样本进行病原学检测，结果检出BVDV阳性率为8.06%。本试验对内蒙古犊牛鼻拭子的BVDV 检出率为30%。以上报道说明BVDV引起的BRDC在我国也流行较广。

4 结论

通过本次实验室检测结果再结合临床症状分析，认为该肉牛场引进犊牛的呼吸道疾病是由BCoV和BVDV混合感染引起的，该场可以采取针对性防控措施。目前，我国对BCoV 和BVDV 引起BRDC 的重视度不足，在生产实践中有必要对其加强防控。