基于网络药理学研究金银花对糖尿病的作用机制

韩明丽田 丹车欣宇余金毅肖 昂潘国军肖 娜

1.山东农业大学农学院，山东泰安 271018；2.山东第一医科大学（山东省医学科学院）生命科学学院，山东泰安 271016

糖尿病是一种糖、蛋白质和脂肪代谢紊乱性疾病，是当前威胁全球人类健康的最主要的非传染性疾病之一，且患病率全球呈上升趋势［1］。根据2019 年国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF）全球糖尿病地图，我国糖尿病患者人数排名第一，约为1.164 亿人；据IDF 预测，2045 年全球糖尿病患病人数将高达7.00 亿，每年有超过420万人死于糖尿病及其并发症。糖尿病已成为非常严重的全球性健康危机［2］。

中医认为糖尿病病因、病机复杂，由饮食不节、情志失调、毒邪侵害等因素引起气阴两虚，并伴有内热的证候，与消渴症类同。长期以来，中医以养阴清热、益气滋阴和活血化瘀等基本治则指导糖尿病的辨证施治。金银花作为我国传统中医药材，具有清热解毒，疏散风热的功效。药理学研究表明，金银花具有抗炎解热、保肝、抗肿瘤、降血脂、降糖等多种生物活性［3］，目前对于金银花治疗糖尿病的作用研究相对较少，大多数是在细胞或整体动物水平上研究其提取物或单体成分的降糖作用［4-6］。但金银花发挥降血糖作用的具体活性成分、作用靶点和作用机制尚未完全阐明，且基于网络药理学和分子对接的方法探讨金银花治疗糖尿病机制的研究较少。本研究利用网络药理学和分子对接的方法筛选金银花与糖尿病有关的活性成分以及靶点，进一步发掘其潜在的作用机制，为后续实验验证和临床应用提供有力的理论依据。

1 材料与方法

1.1 金银花活性成分及靶点的收集

通过中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）收集金银花所有的化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）阈值≥30%和化合物的类药性（drug-likeness，DL）阈值≥0.18 为依据进行筛选；并通过TCMSP 平台筛选出金银花活性成分的作用靶点。

1.2 糖尿病疾病靶点的筛选

在人类基因-疾病相关的数据库（GeneCards）（https：//www.genecards.org/）可提供基因组、蛋白质组、转录、遗传和功能上所有已知和预测的人类基因，在人类基因和遗传紊乱的数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//www.omim. org）主要着重于遗传性的基因疾病，包括文本信息和相关参考信息、序列纪录、图谱和其他相关数据库。分别在两个数据库以“diabetes”进行检索，获取糖尿病疾病靶点，整合到一起，删除重复靶点，并应用R 4.0.4 语言软件将金银花活性成分相关的靶点和疾病靶点进行匹配映射，绘制韦恩图（Venn），以获得金银花活性成分的潜在治疗糖尿病作用靶点。

1.3 药物-活性成分-靶点基因-疾病网络的构建

把1.2获得的金银花的活性成分所对应的靶点基因和糖尿病相关的靶点基因进行匹配映射，获得的二者共同基因作为金银花治疗糖尿病的关键靶点，应用Cytoscape3.8.2 软件构建“药物-活性成分-靶点基因-疾病”关系网络，拆析金银花治疗糖尿病的作用机制。

1.4 糖尿病靶点的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建

String 平台（https：//string-db. org/Version 10.5）是蛋白质相互作用数据库，可搜索已知蛋白之间和预测蛋白质之间相互作用。将金银花和糖尿病共同靶点输入到String 数据库，将研究物种选择为人类（“Homo sapiens”）设 置 置 信 度，标 准 为confidence ＞0.4，并hide disconnected nodes in the network，同时将String中下载的.tsv文件用R 4.0.4语言软件进行处理，根据度值（degree）绘制条形图，得到前30个PPI核心基因靶点。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析

应用Bioconductor 平台（http：//bioconductor. org/bioc Lite.R）和R 4.0.4语言软件对获得的基因进行GO与KEGG富集分析，并将前20个富集结果进行可视化。

1.6 成分—靶点分子对接

先从RSCB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载AKT1的3D结构pdb格式文件，运用AutoDockTools-1.5.6软件去除AKT1中的水分子，并进行加氢，再保存为pdbqt格式文件。从TCMSP数据库（https：//tcmspe.com/）下载活性化合物木犀草素、槲皮素、山柰酚的2D 结构mol. 2 格式文件。利用AutoDockTools-1.5.6软件进行分子对接，先上传去水加氢后的AKT1受体文件，再分别上传配体化合物文件，将其能量最小化，并转化为pdbqt格式文件，再进行分子对接，以结合能大小作为化合物与靶点结合能力大小的判别依据，保存为pdbqt格式的文件，运用Open Babel 3.1.1软件将其转换为pdb格式的文件，最后运用Pymol软件进行可视化分析，输出对接的png格式文件。

2 结 果

2.1 金银花的活性成分及预测靶点

通过TCMSP 平台以OB ≥30%和DL ≥0.18 为依据对金银花进行筛选，得到23 个化学成分，再根据这23 个成分（表1）进行靶点预测，共得到411 个预测靶点。

表1 金银花的主要活性成分

2.2 糖尿病疾病靶点的筛选

在GeneCards 和OMIM数据库以“diabetes”进行检索，获取糖尿病疾病靶点，整合到一起，删除重复靶点，并应用R 4.0.4 语言软件将金银花活性成分相关的122个靶点和17 075个疾病靶点进行匹配映射，绘制Venn 图，获得金银花活性成分的潜在治疗糖尿病作用靶点120个，详见图1。

图1 金银花与糖尿病交集基因Venn图

2.3 金银花-活性成分-靶点基因-糖尿病网络分析

将2.2获得的金银花活性成分的潜在治疗糖尿病作用靶点120 个，绘制网络图，红色箭头为疾病，绿色菱形为药物金银花，黄色方形为金银花的活性成分，淡红色圆形为活性成分对应的作用靶点，详见图2。金银花有16个活性成分对应120个作用靶点与治疗糖尿病有关，对金银花的主要成分进行分析，排名前3的为木犀草素、槲皮素以及山奈酚。金银花的同一活性成分可以作用于不同的靶点，同一靶点又可以受不同的活性成分作用，体现了金银花治疗糖尿病的多成分、多靶点特性。

图2 金银花-活性成分-靶点基因-糖尿病网络图

2.4 PPI网络构建与分析

将金银花和糖尿病共同靶点输入到String数据库，得到金银花与糖尿病的PPI网络，图中节点之间的连线表示两者之间存在相互作用，颜色不同则相互作用类型不同，连线越多则作用越密切，节点数为120，边数为1 655，平均节点度为27.6，平均局部聚类系数为0.624，详见图3A。同时将String 中下载的. tsv 文件用R 语言软件进行处理，根据度值（degree）绘制条形图，并通过barplot可以更直观地看出各节点所连接节点数，越多则该节点在网络中的作用越关键，得到前30个PPI核心基因靶点，其中关联度值最高的前5个节点依次为AKT1（85）、TP53（85）、ALB（81）、IL6（78）、VEGTA（74），详见图3B，表明了这些基因可能是金银花治疗糖尿病的潜在靶点。

A为金银花与糖尿病的蛋白相互作用网络；B为治疗糖尿病的核心靶点

2.5 GO、KEGG功能富集分析

应用Bioconductor 平台和R 语言软件对获得的基因进行GO、KEGG 富集分析。绘制GO 气泡图，P值代表富集的显著性，相应的P值越小，其颜色越偏向红色，反之颜色偏向蓝色，横坐标表示富集数目，金银花治疗糖尿病作用机制主要涉及DNA结合转录因子结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合等生物过程，详见图4A。绘制KEGG气泡图，横坐标为基因比例（gene ratio），纵坐标为富集在每个GO 上的基因数目，富集结果的-log10（Q value）值以颜色表示，气泡大小表示基因的Count 值，总共有149 条通路，设定一定的筛选条件得到20条关键通路，其中与治疗糖尿病有关的包括脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、PI3K-AKT 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）和肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等，详见图4B。以上结果提示，金银花通过多通路协同作用治疗糖尿病。

A为金银花治疗糖尿病的GO富集分析柱状图；B为KEGG富集分析点图

2.6 金银花核心化合物作用于AKT1的分子对接

分子对接结果显示，将排名前3 位的活性化合物与AKT1 进行分子对接，配体与受体结合时所需的结合自由能越低，则说明其结合构象越稳定，与AKT1 结合能最低的化合物分别为山柰酚（图5A）（结合能为-5.5 kcal/mol 和-5.49 kcal/mol）、槲皮素（图5B）（结合能为-5.13 kcal/mol和5.07 kcal/mol）、木犀草素（图5C）（结合能为-4.81 kcal/mol 和-4.24 kcal/mol），受体中心不同颜色的小分子代表配体，黄色虚线代表氢键。

A为山柰酚；B为槲皮素；C为木犀草素

3 讨 论

金银花及含金银花复方治疗糖尿病相关的疾病已有研究［6-7］，但金银花治疗糖尿病的活性成分、作用靶点以及作用机制尚不完全明确。近年来研究者通过网络药理学方法，进行系统生物学、生物网络构建和分析等，评价中药的药理作用，阐明中药有效活性成分和潜在的疾病作用靶点，进而探索中药发挥药效的分子机制［8-10］。

本研究采用网络药理学的方法分析并探讨金银花治疗糖尿病的活性成分、关键靶点和信号通路，发现金银花中有16 个活性成分针对与糖尿病有关的120 个靶点发挥作用，这些活性成分发挥抗糖尿病作用的主要作用靶点为AKT。应用R 4.0.4语言软件包及Bioconductor 生物信息软件包对金银花潜在作用的糖尿病靶点进行GO分析，结果显示，金银花治疗糖尿病作用机制主要涉及DNA 结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等生物过程，可通过AKT、白介素-6（interleukin 6，IL-6）、TP53等作用靶点参与脂质与动脉硬化、PI3KAKT信号通路等多条通路共同发挥作用。AKT1是称为AKT 激酶的3 种紧密相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2 和AKT3）之一，它调节许多过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成。AKT是PI3K下游的重要靶标激酶，PIP3可与AKT结合，将AKT 从细胞质转移到细胞膜，并通过磷酸化Ser473 和Thr308，从而使AKT 完全激活，进而启动PI3K/AKT 信号传导途径［11］。Btk 是一种胞浆蛋白，属于Tec 酪氨酸激酶家族成员之一，含有PH 结构域，与PIP3结合后同样可以磷酸化AKT（S473）并激活AKT信号通路，在PI3K抑制剂作用下，AKT1和位于Btk上游的PIK3CD基因处于高活化状态，说明激活Btk-AKT1 信号通路有助于胰岛素分泌细胞的分化及成熟过程［12］。miR-191水平通过抑制IRS1/AKT途径和GLUT4从细胞质到质膜的易位，进而逆转了亚砷酸盐诱导的葡萄糖消耗、糖原水平、质膜GLUT4和p-AKT 水平的降低［13］。在db/db小鼠肝脏中，PI3K-AKT 信号通路可以抑制糖异生途径，减少葡萄糖的输出，从而发挥降糖作用［14］。研究报道金银花提取物可以通过下调肝脏中PGC-1α发挥降糖作用［15］。

黄酮类成分是金银花的活性成分，具有多种药理作用［16］。通过对金银花的主要活性成分进行分析，得知排名前3 的为木犀草素、槲皮素以及山奈酚。木犀草素可以增加心肌组织中AKT 磷酸化，改善Ⅰ型糖尿病心肌病患者的心力衰竭［17］。槲皮素通过增加大鼠肝脏组织中AKT 磷酸化，改善糖尿病大鼠的糖脂代谢紊乱［18］。在异丙肾上腺素诱导的糖尿病大鼠心衰模型中，山奈酚通过调控PI3K/AKT 信号通路和炎性通路对心脏起到保护作用［19］。

炎症与糖尿病的发生发展密切相关，IL-6 作为炎症反应的重要细胞因子，在糖尿病患者血清中含量较高［20］。金银花提取液通过抑制TNF-α 和IL-6的释放而产生抗炎作用［21］，由此推测，金银花可能通过抑制炎症反应发挥降糖作用。本团队前期研究也发现木犀草素、槲皮素可以通过激活AMPK 和SIRT1 抑制TNF-α 和IL-6 的释放，从而改善脂肪细胞的胰岛素抵抗［22］。

综上所述，本研究以金银花主要活性成分为研究对象，通过网络药理学方法预测了金银花治疗糖尿病的作用靶点及作用机制，初步阐明金银花通过多靶点、多通路治疗糖尿病，为进一步实验研究和临床应用提供了新思路、指明了新方向。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突