嗅鞘细胞移植对脊髓损伤大鼠Wnt/β-catenin信号分子影响

冯 芮潘 飞王晓玉陈浩月陈悦霞郑遵成

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东泰安 271016；2.东平县中医院，山东泰安 271500；3.东平县人民医院，山东泰安 271500；4.泰安市中心医院，山东泰安 271000

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是当今社会致残的主要原因之一［1］，临床治疗及康复效果欠佳，损伤后的功能障碍多由原发性机械损伤、继发性细胞死亡、反应性胶质增生和受损轴突再生能力差等多种因素引起［2］。脊髓损伤中心多为坏死性神经性死亡，继发性变化导致损伤周围组织缺血、缺氧、兴奋性毒性等，特别是大量远离损伤中心的少突胶质细胞的死亡，会导致脱髓鞘和轴突传导恶化［3］。最终导致病理学上的病变远远大于最初的机械性创伤，甚至可能导致某些功能永久性丧失。

嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移植是目前脊髓损伤疗效较好的治疗方法之一。OECs 存在于中枢和周围神经中，是一种特殊的在功能上介于雪旺细胞和少突胶质细胞之间的胶质细胞，具有营养神经、抑制胶质增生与瘢痕形成、成鞘等作用，可以为脊髓损伤部位新生轴突生成与神经传导的建立提供基础［4］。研究表明Wnt/β-catenin信号通路可能参与成年组织（包括脊髓）的稳态和疾病进展，成年大鼠脊髓中存在大多数Wnt 配体、受体和抑制剂的组成性表达以及活跃的典型Wnt信 号［5-6］。而OECs 移 植 后 是 否 通 过 激 活Wnt/βcatenin 信号通路发挥作用的相关报道较少。本研究旨在通过观察经OECs移植后大鼠脊髓组织Wnt/β-catenin 信号通路的关键分子Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、c-myc的表达变化，为脊髓损伤细胞修复提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

健康成年体质量（180 ± 10）g 雄性SD 大鼠60只，购买于济南朋悦实验动物繁育有限公司［许可证号：SCXK（鲁）20190003］，常规饲养1周后随机分为3组，每组30只，分别为空白组：T9-11椎板去除；损伤组：T10脊髓损伤；移植组：T10脊髓损伤，OECs移植。

1.2 OECs提取与培养

新生3~5 d 乳鼠4 只，采取断颈取头法将其处死，逐层剪开乳鼠头部，将暴露在两侧脑半球前端的椭圆形嗅球用平头镊子小心夹出，放入盛有DMEM/F12 培养基的小号培养皿中，眼科剪将嗅球组织剪碎，离心后转移至6 孔板中，放入37 ℃温箱中培养，取培养至第三代的细胞进行移植。

1.3 慢病毒标记OECs

采用阴性对照病毒CON077（上海吉凯基因医学科技股份有限公司）感染OECs。用OECs 完全培养基制备密度为（3~5）×104个/mL的细胞悬液，接种到6 孔板中；37 ℃培养24 h 后更换培养基，并在每孔中加入40µL 感染增强液；37 ℃培养12 h 后更换完全培养基，继续培养；感染后约72 h，观察感染效率，进行后续实验。

1.4 模型制备及细胞移植

10%水合氯醛腹腔注射（0.4 mL/100 g）麻醉，15~20 min后将大鼠俯卧位固定在操作板上，背部剃毛器剃毛，碘伏常规消毒。确定T10水平，实施背侧正中切口，切口的长度为3 cm，空白组仅做T10椎板切除，其余两组在暴露脊髓后采用改良的Allens＇打击器，在T10脊髓节段打击脊髓，出现鼠尾摆动表明打击成功，移植组在损伤脊髓上0.5 cm处用微量进样器注射1µL密度为1×105/µL的OECs，然后依次缝合各层组织，关闭伤口，无菌敷料予以包扎。术后即刻注射青霉素针（2 万U/100 g），连续腹腔注射3 d，预防术后感染。造模术后，每只大鼠分笼饲养，保持鼠房的适宜温度（22 ~ 26 ℃）和空气湿度（50% ~ 70%），每日2 次人工按摩辅助排尿。如果大鼠意外死亡，模型需重复再造以作补充。在大鼠造模前和造模后7 d、14 d，由两名不了解本操作和专业的观察者依据运动功能评分表（basso beattie bresnahan，BBB）对大鼠双后肢功能进行评分，行BBB评分后提取脊髓组织。。

1.5 定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）测定

3组大鼠每组取15只，分别于移植后1、3、5、7、14 d 冰上处死，每个时间点3 只，采用总RNA-纯细胞/组织总RNA分离试剂盒（南京诺唯赞RC-112）从脊髓组织中快速提取总RNA；用HiScriptⅡ一步法RT-PCR试剂盒（南京诺唯赞RC-112）反转录cDNA；使用RapidTaqMasterMix（南京诺唯赞P222）进行PCR 引物扩增（Roche 公司，LightCycle96）。引物由铂尚生物技术（上海）有限公司合成（表1）。

表1 Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、c-myc及内参GAPDH引物序列

1.6 免疫组化

3 组大鼠分别于术后7 d 各取3 只，取材（方法同上），4%多聚甲醛常规固定组织，制作冰冻切片，切片按程序进行脱蜡和水化后，内源性过氧化物酶室温孵育10 min，PBS 溶液重复洗涤3 次，每次3 min；用组化笔在组织周围画圈，5%山羊血清在湿盒中室温封闭30 min；滤纸吸干血清后，将抗NF200一抗（稀释比例为1∶400）滴入组织，玻片放在湿盒中4 ℃过夜；第二天取出37 ℃复温45 min，一抗弃掉，PBS溶液重复洗涤5次，每次5 min；滤纸吸干水后37 ℃温箱二抗孵育30 min；二抗弃掉，PBS 溶液重复洗涤5 次，每次5 min；后用DAB 染色液显色3 min，苏木精复染3 min，最后脱水、干燥、中性树胶封片。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 OECs的培养鉴定

单个OECs胞体突起变长，呈双极形或梭形，细胞排列呈栅栏状或连接成网状。经慢病毒标记荧光显微镜下显示，OECs 呈绿色细长条状，胞体饱满且较大，群集分布。损伤7 d 脊髓荧光显微镜下可见组织轮廓，大脑灰质密度均一；经绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记移植后脊髓灰质内呈现密集分布、颜色较亮、数量较多的OECs。见图1。

A 为正常培养OECs，比例尺：100µm；B 为慢病毒感染OECs，比例尺：100µm；C 为SCI 后7 d 荧光显微镜下脊髓，比例尺：200µm；D 为SCI 后荧光显微镜下GFP 标记OECs 移植7 d 脊髓，比例尺：200µm

2.2 BBB评分

移植组术后14 d BBB评分高于损伤组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。表明OECs 移植对脊髓损伤大鼠运动功能恢复有较为明显的影响。

表2 3组大鼠移植后BBB评分

2.3 qPCR检测结果

空白组不同时间点各信号分子表达稳定，趋势较为平稳；损伤组Wnt-1、GSK-3β 与c-myc 总体呈下调趋势，β-catenin 有小幅上升，但都呈明显抑制状态，详见表3 ~ 6；与损伤组比较，移植组除Wnt-1 呈小幅上调趋势外，β-catenin、GSK-3β 与cmyc 均呈较高表达，明显减轻了损伤后的抑制状态，详见图2~5。

图2 Wnt-1在不同时间点mRNA表达变化

表3 Wnt-1不同时间点mRNA表达变化

2.4 免疫组化情况

免疫组化显示空白组神经丝蛋白-200（NF-200）阳性细胞是神经元细胞，为棕色，数量较多，胞体较大且饱满，细胞核大而圆，核仁较明显；对照组阳性细胞数量较少，胞体变性且缩小，核仁消失；细胞组胞体呈现细长锥形，核仁出现并位于中央，数量较对照组增多，且形态更接近于空白组细胞，即正常的神经元细胞，提示OECs 移植可以促进神经元细胞的增殖。详见图6。

A为移植组；B为空白组；C为损伤组；免疫组化染色，比例尺均为50µm

3 讨 论

脊髓损伤是年轻人最常见的死亡原因，对患者的社会生活和经济生活影响往往比其他损伤更为显著。脊髓损伤的发病率存在地域差异，发病率从12 例/百万人到65 例/百万人不等，且经济越发达的地区，发病率越高［7-9］。当前的医疗技术并未攻克脊髓损伤的难题，但OECs 移植对神经元的修复作用逐渐得到专家的认可，并成为研究的热点。OECs 起源于嗅基底膜，存在于周围神经和中枢神经中，在中枢神经系统内能长距离的迁移，是一种能够终生促进嗅神经元轴突生长和再生的胶质细胞［10］。2003 年开始研究相继报道自体嗅鞘或嗅球组织移植SCI 患者获得了一定程度的神经功能恢复，之后许多学者对OECs 移植进行了更加深人的研究，并取得了不同程度的进展［11-13］。OECs 移植后，Wnt 信号通路关键分子在脊髓损伤部位发挥了重要作用，但其具体机制还未完全明确。

表4 β-catenin不同时间点mRNA表达变化

表5 GSK-3β不同时间点mRNA表达变化

表6 c-myc不同时间点mRNA表达变化

图3 β-catenin在不同时间点mRNA表达变化

图4 GSK-3β在不同时间点mRNA表达变化

图5 c-myc在不同时间点mRNA表达变化

Wnt 基因自发现以来，目前已有19 个配体和14 个受体，至少激活3 种不同的信号途径，包括经典的Wnt/β-catenin 信号通路、非经典的Wnt-JNK 信号通路和Wnt-Ca+信号通路［14］。在经典的Wnt/βcatenin 信号通路中，有Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4等经典的信号分子，它们参与调节干细胞和祖细胞的增殖和分化，在胚胎发育和成体组织稳态中发挥着重要作用［15］。GSK-3β、APC 与Axin 则形成一种复合物，当Wnt 配体缺乏时，β-catenin 被复合物所降解；当Wnt配体存在时，β-catenin可通过Wnt受体与配体的结合，进入细胞核，与T 细胞转录因子/淋巴样增强因子（TCF/LEF）相互作用，激活下游基因，调控细胞增殖与凋亡等变化［16-17］。

本研究发现，经过OECs 移植之后的大鼠BBB评分明显增高，移植后脊髓局部神经元细胞也有不同程度增加和形态改善，表明OECs 移植可以促进神经元增殖，从而促进大鼠运动功能恢复。qPCR 显示脊髓损伤后，Wnt-1、β-catenin、GSK-3β和c-myc 总体呈下调趋势，Wnt/β-catenin 通路被抑制，而OECs 移植后，Wnt/β-catenin 通路抑制性明显减轻。

研究发现，脊髓损伤后神经干细胞在短时间内募集，Wnt/β-catenin 信号通路可能被激活参与其中［18］。本研究中脊髓损伤并未激活Wnt/β-catenin信号通路，可能由于细胞微环境变化、凋亡、焦亡等原因，自我修复未有效启动，而经OECs 移植后，减轻了Wnt/β-catenin信号通路损伤后的抑制状态，可能协同参与神经干细胞的增殖反应，从而起到修复受损神经元的作用，但OECs 移植后Wnt/β-catenin信号通路的调控趋势仍较正常低，相关原因在未来的研究中将会继续探讨，改良OECs 或联合其他方法治疗脊髓损伤或许成为今后改进的方向。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突