针刺治疗脑出血氧化应激机制研究进展

董珊珊,孔 莹,邹 伟

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑出血(Intracerebral hemorrhage ，ICH)是神经科学领域常见的危重疾病之一。据《2016年全球疾病负担研究》《中国中风》部分报告， ICH已是全球死亡率最高的中风亚型，我国的ICH发病率高于其他高收入国家[1-3]。然而，目前临床上有关ICH的治疗选择十分稀缺[4]。氧化应激(Oxidative Stress，OS)是自由基产生与清除失衡导致的一种氧化过渡状态。现代医学研究认为自由基爆发是恶化ICH继发性脑损伤的关键病理因素[5]。近年来有关针刺治疗ICH氧化应激的研究取得一定进展。邹伟教授实验团队的前期研究证实，针刺参与调控与OS相关的通路蛋白表达，有效地改善ICH脑组织氧化损伤[6]。但关于针刺治疗ICH氧化应激的确切机制目前尚无定论。因此，本研究试从ICH后自由基来源进行分析与探究，对针刺治疗ICH氧化应激作用机理加以阐述。

1 ICH与自由基-氧化应激

大脑是OS的敏感部位。大脑的高耗氧和脑部神经元细胞膜富含多不饱和脂肪酸,使得脑组织更易于自由基产生。然而生理状态下，脑内含有天然的抗氧化酶系统调控自由基水平，使自由基的产生与降解之间存在着微妙的平衡。ICH发生后血液成分的泄漏使得脑部抗氧化系统迅速被自由基所淹没，发生OS。研究表明，ICH后氧化产物(如MDA、8-OHDG)的水平升高，而抗氧化酶(如SOD、GSH-Px及CAT)活性则会降低，OS诱导的脑损伤主要是通过自由基(主要是ROS)直接引起细胞生物大分子氧化和激活细胞死亡通路，导致长期的神经功能缺陷[5]。动物研究已经证实抗氧化剂(NSP-116)通过有效抑制自由基生成，改善ICH大鼠的神经功能缺损[8]。可见，自由基剂量是决定OS的关键参数，而OS与ICH的整体预后高度相关。

2 ICH后的自由基来源

2.1 炎性细胞活化

神经炎症与OS是互为依赖的两个表型。神经炎症的成分主要包括小胶质细胞、星形胶质细胞和T淋巴细胞[9]。ICH后炎性细胞活化不仅伴有炎性因子(如IL-1β和TNF-α)释放，也会产生大量的自由基导致脑损伤。

小胶质细胞是参与ICH病理过程最早和最主要的炎症细胞。其通过激活和形成M1(促炎)或M2(抗炎)表型对急性脑损伤做出应答。在ICH发作的7 d内，小胶质细胞的M1表型向M2表型转化[9]，而表型间的转移不平衡会产生大量ROS。细胞实验表明，小胶质细胞可以在体外诱导ROS产生[10]。此外，在ICH大鼠模型中，抑制小胶质细胞和星型胶质细胞活化可减少促炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的释放，降低ROS的产生和脑损伤量[11]。ICH后，小胶质细胞中的NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)炎症小体激活，引起炎症级联反应[12]。采用apelin-13抑制小胶质细胞的活化，可以降低脑组织NLRP3和ROS的产生[13]。Hu L等[14]的细胞和动物实验发现通过miR-152的过度表达，可以阻断硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)介导的NLRP3炎症小体激活，减少了ROS产生。此外，NLRP3炎性小体通过促进中性粒细胞浸润来放大ICH后的炎症反应导致呼吸链爆发，抑制NLRP3炎症小体可以有效降低中性粒细胞浸润、缓解氧化损伤[12]，中性粒细胞是治疗ICH的新兴靶点。

2.2 线粒体功能障碍

线粒体是氧和ROS的枢纽，ICH病理条件下，受损线粒体累积是毒性ROS的主要来源。这种损伤主要是由于线粒体的过度分裂打破线粒体稳态，最终造成线粒体功能障碍。线粒体功能障碍主要通过损害三磷酸腺苷(ATP)合成和诱导ROS生成过量加重继发性脑损伤[15]。因此，参与线粒体融合-分裂动态平衡的调控因子(如UCP2、NRF-1及TFAM)可能与自由基的产生密切相关。原代神经元研究表明，线粒体断裂和膜电位丧失会导致ROS累积[16]。Kadlec AO等[17]发现调节线粒体功能的主要转录共激活因子过氧化物酶体增殖激活受体共激活因子-1α(PGC-1α)缺乏会导致线粒体功能障碍发生OS。ICH后PGC-1α的表达抑制会显著降低脑组织ATP浓度，抑制线粒体的生成数量和功能，下调SOD2酶水平，增加脑含水量和线粒体髓鞘层结构的形成[18]。相反，诱导PGC-1α激活则会促进线粒体功能恢复，减少脑组织细胞内ROS和线粒体ROS产生[19]。说明ICH后PGC-1α参与线粒体途径的OS调节，PGC-1α对OS具有正向调控作用。

此外，线粒体自噬能够调控线粒体稳态、促进线粒体更新以及限制ROS过量累积。激活Pink1/-Parkin通路介导的线粒体自噬能够减少高血压脑出血大鼠模型中功能失调的线粒体产生，减少脑组织梗死体积[20]。其次，一些抗氧化剂通过参与线粒体稳态间接抑制ROS产生。ICH后，上调谷胱甘肽(GSH)水平能够促进线粒体氧化呼吸功能恢复，减轻急性脑损伤[21]。DJ-1是一种具有活性氧清除和酶活性调节等多效功能蛋白，应激条件下，DJ-1单体化从细胞质转位至线粒体保护细胞免受氧化损伤[22]。ICH后，激活DJ-1/Akt/IKK/NFκB通路可以有效抑制线粒体介导的OS[23]。可见，线粒体功能障碍是自由基生成的重要来源。

2.3 铁离子超载

铁参与有氧呼吸的电子传递链以及血红蛋白中的氧气传输，铁的稳态对于大脑功能运行至关重要。由于铁离子具有毒性作用，生理状态下脑组织内几乎不存在游离的铁离子(Fe3+)或亚铁离子(Fe2+)。ICH发生后，脑组织神经元内的铁离子主要由血液成分中的血红蛋白衍生。过量的游离铁释放通过Fenton和Haber-Weiss反应，生成超氧阴离子和高活性羟基自由基，导致脑铁稳态失调促进OS[24]。Garton T等[25]指出Fenton反应中亚铁与过氧化氢的相互作用生成氧化活性分子，即：Fe2++H2O2Fe3++OH·+OH-，生成的Fe3+又可以通过各种还原剂还原为Fe2+，造成自由基生成反应的恶性循环。

ICH后铁离子超载引起氧化损伤的途径复杂多样，一方面，神经细胞内铁离子的过度积累会触发铁死亡，而铁死亡通过抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)介导ROS的累积[26]。另一方面，铁死亡通过加重神经炎症和线粒体功能障碍恶化自由基生成。使用铁死亡抑制剂去铁胺(DFX)可以显著减少ICH小鼠模型血肿区ROS的产生以及小胶质细胞和中性粒细胞的炎性浸润[27]。Chen B等[28]发现，在体内和体外ICH模型中，铁死亡相关基因PTGS2的表达水平均升高，而RPL8仅在人脑组织中升高，小鼠ICH 3 h后铁和MDA水平显著升高，线粒体体积缩小。

3 针刺对ICH氧化应激的调节作用

3.1 针刺激活内源性抗氧化酶系统

内源性抗氧化酶系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)等。抗氧化酶活性的高低直接影响机体的抗氧化能力强弱。大部分研究发现，针刺能够升高内源性抗氧化酶活性，如SOD、CAT及GSH-Px，来对抗过氧化影响[29]。针刺能够促进病理状态下脑组织SOD、CAT及GSH-Px等抗氧化酶释放，通过增强脑组织的抗氧化能力，改善自由基代谢，抑制OS，这一点在诸多研究中均有证实，如高血压大鼠延髓区[30]、血管性认知障碍大鼠大脑皮层区[31]以及脑缺血再灌注大鼠脑组织半暗带区[32]。

机体内，SOD能催化超氧阴离子发生歧化反应产生H2O2和O2。据报道，音乐电针患肢曲池、合谷、髀关及后三里穴能够提高ICH模型大鼠SOD活力,促进神经功能缺损恢复[33]。Liu等[34]发现，与单纯西药治疗相比，逐瘀通腑系列方药加针刺治疗可以显著降低高血压脑出血患者血浆LPO、血细胞比容和全血粘度含量，升高SOD、GSH-Px活性。罗松等[35]在针刺治疗ICH的机理研究中发现，在ICH急性期，针刺水沟、风府、曲泽、内关、三阴交、血海和太溪穴位能显著增强动脉粥样硬化兔脑出血模型的脑SOD活性。此外，针刺可显著抑制ICH大鼠模型磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)蛋白表达，并减少神经功能缺损[36]，这可能与转录因子STAT3调节的MnSOD激活相关[37]。因此，激活内源性抗氧化酶系统是针刺治疗ICH的机理之一。

3.2 针刺抑制自由基的过量生成

针刺疗法通过调节脑内自由基-氧化应激系统，增强神经系统抗氧化能力[38]。OS病理过程中存在着复杂的信号通路网络，因此引起自由基产生的潜在途径可能与针刺的抗氧化机制密切相关。

脑保护因子脑红蛋白(NGB)是一种运输与储存氧的球蛋白，可以维持出血损伤的线粒体形态结构完整及其有氧氧化功能。韩佳炜等[39]发现，ICH后脑组织NGB的表达呈内源性升高，但不足以抵抗氧化损伤，针刺“人中”“内关”能使ICH后脑组织中NGB表达进一步升高，通过保护受损神经元线粒体形态结构的完整，对抗OS及神经元凋亡。ICH的线粒体功能障碍发生后，线粒体氧化呼吸链末端的关键限速蛋白细胞色素C(Cyt C)从线粒体释放致使氧化呼吸链中断，ROS生成增多。韩佳炜等[40]通过针刺“人中”“内关”改善线粒体的损伤程度，抑制ICH后Cyt C的释放，减少神经元凋亡。针刺还可以显著抑制ICH后NLRP3激活引起的炎性细胞浸润[41]。此外，在针刺抗ICH氧化应激损伤的研究中也发现了针刺可以有效减少ICH后炎性细胞浸润[6]，说明针刺对ICH大鼠的抗氧化作用机制也参与抑制炎性细胞浸润，从而下调自由基产生水平。核因子E2-相关因子2(Nrf2)是氧化还原主要的敏感转录因子，Nrf2受Keap1的负调控，ICH后ROS的过量产生刺激Nrf2从Keap1解偶联并重定位至细胞核，然后激活介导细胞存活的抗氧化反应元件(ARE)依赖性细胞保护基因。头针“百会”透“曲鬓”通过激活Nrf2-ARE通路诱导下游血红素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)的表达,从而减缓ICH氧化应激损伤[6]。Nrf2通路激活是缓解ICH氧化应激的有望靶标。

3.3 针刺保护细胞大分子免受氧化损伤

针刺可以保护细胞蛋白质、脂质和DNA免受氧化损伤。通过对丙二醛(MDA)、过氧化脂(LPO)、单氨氧化酶 (MAO)和脂褐质 (LF)等氧化指标的研究，发现针刺具有减少脂质氧化损伤的有益作用[29]。LPO是一种过氧化脂质，正常情况下低浓度存在，脂质的过氧化损伤会致使LPO升高。针刺治疗ICH在稳定地增强脑出血兔抗自由基酶活性的同时，降低LPO含量[35]。MDA是脂质氧化损伤的终产物，具有细胞毒性，导致蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合。研究发现，音乐电针选穴患肢曲池、合谷、髀关及后三里治疗ICH能显著降低脑组织及血清MDA[33]。HO-1参与血红素的代谢以及机体内抗炎和抗氧化过程，黄俊涛[42]发现电针内关(双侧)、三阴交(双侧)及水沟穴治疗ICH通过提高脑内HO-1和HO-2含量减轻OS反应，但ICH急性期应慎重选择电针治疗。此外，8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHDG)是DNA氧化损伤的突变标志物，ICH患者的白细胞8-OHDG水平显著高于健康人群[43]，针刺疗法具有降低脑组织8-OHDG的作用[44]，但关于ICH的研究有待进一步验证。

4 讨论

脑出血在中医理论中属于“中风”范畴。其基本病机为气血逆乱，上犯于脑，血溢脑络导致脑络阻痹、神明不调。针刺治疗中风病在我国最早记载于《黄帝内经》，而后东晋时期葛洪的《肘后备急方》也曾强烈推荐针刺作为中风急性期的急救方法。针刺具有调神通络、醒脑开窍等功效，通过针刺特定穴位对ICH患者的神经功能缺损有改善作用[45]。

现代医学研究发现针刺在减少OS、促进ICH神经功能恢复方面具有显著疗效。本研究通过对现存文献的分析得到针刺的抗氧化作用是多方面、多机制的共同作用结果：其一，针刺既能阻断ICH的自由基来源，又能中和已生成的过量自由基；其二，针刺通过抑制炎性细胞活化、改善线粒体呼吸功能和减少铁离子超载多种途径阻断自由基产生；其三，针刺能增强内源性抗氧化酶(如SOD、CAT及GSH-Px)活性来中和已生成的自由基，防御OS；其四，针刺能够直接减少细胞大分子(如脂质、蛋白质及DNA)的氧化损伤；其五，针刺能够调节与ROS产生或消除相关的信号通路，抑制自由基过量生成，如Cyt C和Nrf2通路。

尽管针刺相对于单一靶点治疗ICH具有显著优越性，但目前有关针刺抗氧化作用的主要原因还未确定。此外，针刺是一种复杂的治疗方法，当前针刺研究中存在诸多变量，不同针刺参数(针刺时间、针刺类型和穴位选择等)的抗氧化能力以及针刺改善ICH氧化应激更多的调控通路机制都有待探究阐明。同时应该加入更多的临床数据来增加针刺对抗ICH氧化应激的理论支持，将能为今后的临床针刺治疗ICH氧化应激提供更多依据和针刺参数方案选择，以帮助更多ICH患者提高生活质量。