HPLC法测定化妆品中盐酸美满霉素等七种组分的条件优化研究

王 颖 张 曲 韦靖婧 代仕梅 陈长安

（资阳市食品药品检验检测中心，四川 资阳 641399）

化妆品常见添加的抗生素主要有氯霉素类、甲硝唑、四环素类、喹诺酮类咪唑类等。这些成分最常出现在祛痘抗粉刺类、祛螨类化妆品中。祛痘抗粉刺类化妆品是近年来检测出非法添加抗生素最多的化妆品品种。这与痘痘（痤疮）发病原理有关。痤疮的发生主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞、细菌感染和炎症反应等因素密切相关，而局部外用抗生素本身就是治疗痘痘的有效方式之一。但是人体长期接触含抗生素的化妆品，易引起接触性皮炎、抗生素过敏等症状，易产生耐药性。药物残留还可能导致过敏反应等。化妆品的检测规范，都将抗生素列为禁用物质，即不得作为化妆品原料使用。

1 现行的检测规范检测条件试验情况

现行的检测规范给出了盐酸美满霉素、二水土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素6 种抗生素和甲硝唑7种组分的测试方法。但方法中混合标准品储备溶液的配制中，未给出甲醇及0.1mol/L盐酸溶液的具体用量，实际操作过程中只能一步一步尝试，无法让试验人员进行标准化操作；按照其给出的方法进行检测时发现，盐酸美满霉素色谱峰出现了双峰且盐酸多西环素与氯霉素的色谱峰的分离度不能达到1.5（色谱图见图1），用现行检测规范给出的检测方法进行检测，无法对盐酸美满霉素等七种成分进行准确的分离和定量，所以需要对该检测方法的条件进行优化。

图1 现行检测规范给出的检测方法色谱图

2 试验部分

2.1 试剂与仪器

样品为膏霜类祛痘抗粉刺产品，10批（S1-S10）购于本市内的各大型化妆品连锁门店，化妆品的外观标识均符合相关规定；近年来网络电商平台发展迅速，尤其是直播电商购物风头正劲，但是直播电商购物经常会出现商家或者是主播虚假夸大宣传、商品质量差、以次充好、假冒伪劣等情况，所以本试验特选取10批样品（S11~S12）购于网络（包括直播带货平台）中，所购10批样品中存在一批未标注生产许可证号，两批标注有禁止用语（医疗术语）的情况。

盐酸、磷酸、草酸优级纯：成都市科龙化工试剂厂；乙腈和甲醇为色谱纯：美国赛默飞世尔科技公司；水为超纯水；盐酸美满霉素、二水土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素对照品来源于MANHAGE，甲硝唑对照品来源于中国食品药品检定研究院。

Agilent1260高效液相色谱仪（配DAD检测器）：安捷伦公司；十万分之一电子天平：梅特勒；pH计：梅特勒；超纯水机；超声波清洗器等。

2.2 方法

色谱柱：日本岛津 Shim-pack VP-ODS 4.6mm×250 mm，反相柱5μm，柱温：30℃，流速：0.8mL/min，进样量：10μL，检测波长；268nm，流动相：0.003mol/L草酸溶液（磷酸调节pH至2.5）∶乙腈 ∶甲醇（70 ∶10∶20）。

称取7种抗生素对照品适量，用甲醇∶盐酸（0.01mol/L）（7∶3）溶液溶解，配制质量浓度为250 mg/L的混合标准储备溶液，再逐级稀释成浓度约为2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和50mg/L 的混合标准系列溶液。分别吸取上述溶液10μL注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，以峰面积A对进样质量浓度进行线性回归（为质量浓度，为峰面积），线性方程、回归方程、相关系数见表1，由表1可知7种抗生素的回归方程线性较好，相关系数均在0.997以上。

表1 7种抗生素的线性范围、回归方程、相关系数

准确称取样品 2.5 g（ 2份）于25mL具塞比色管中，加入甲醇 ∶盐酸（0.01mol/L）（7 ∶3）溶液20mL，振摇均匀，超声提取30min，冷却至室温后定容至刻度，经0.45μm滤膜过滤后，滤液作为供试品溶液。

3 结果与讨论

3.1 优化后质量浓度

优化条件后质量浓度为5mg/L 7种抗生素混合标准品的色谱图，见图2。

图2 优化条件后质量浓度为5mg/L 7种抗生素混合标准品色谱图

3.2 重现性试验

取同一不含待测组分的样品6份，精密加入混合标准储备液1.50ml，按照供试品溶液的制备方法和色谱条件进行测定，分别记录6份样品中盐酸美满霉素、甲硝唑、二水土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素和氯霉素7种抗生素的峰面积，七种抗生素6份样品中峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.57%、0.55%、0.97%、0.86%、1.05%、0.78%、0.88%，表明其重现性良好。

3.3 稳定性试验

取重现性试验的一份供试品溶液，室温放置，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h按上述色谱条件进行测定，分别记录盐酸美满霉素、甲硝唑、二水土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素和氯霉素7种抗生素的峰面积，七种抗生素在0h、2h、4h、8h、12h、24h的色谱峰峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.85%、0.65%、1.08%、0.93%、1.12%、1.67%、1.30%，表明其稳定性良好。

3.4 准确度

准确度以加标回收率表示，称取不含待测组分的同一样品9份，3份精密加入混合标准储备溶液0.50mL，3份精密加入混合标准储备溶液1.00mL，3份精密加入混合标准储备溶液1.50mL，按照供试品溶液的制备方法制成3组不同浓度的样品做三水平三平行的添加回收试验。记录测定的峰面积，计算回收率。试验结果表明7种抗生素的平均回收率为101.24%~109.29%，相对标准偏差（RSD）为0.36%~1.74%（=3），平均回收率和相对标准偏差（RSD）见表2。

表 2 7 种抗生素的平均回收率和精密度（n=3）

3.5 方法检出限与定量限

以信噪比（/）为3时对应的浓度为检出限，盐酸美满霉素、甲硝唑、二水土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素和氯霉素7种抗生素的检出限分别为2.81mg/kg、3.68mg/kg、4.29mg/kg、2.65mg/kg、2.93mg/kg、3.82mg/kg和1.89mg/kg；以信噪比（/）为10时对应的浓度为检出限，盐酸美满霉素、甲硝唑、二水土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素和氯霉素7种抗生素的定量限分别为9.37mg/kg、12.27mg/kg、14.30mg/kg、8.83mg/kg、9.77mg/kg、12.73mg/kg和6.30mg/kg。

3.6 样品含量测定

20个样品，每个样品各平行称取2份，每份约2.5g精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，取制成的供试品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录7种组分的峰面积，利用外标一点法计算含量，各样品的含量分别为S1：未检出；S2：未检出；S3：未检出；S4：未检出；S5：未检出；S6：未检出；S7：未检出；S8：未检出；S9：未检出；S10：未检出；S11：未检出；S12：未检出；S13：检出甲硝唑，含量为546.46mg/kg；S14：未检出；S15：未检出；S16：未检出；S17：未检出；S18：未检出；S19：未检出；S20：未检出。

4 分析方法的确定

4.1 混合标准品储备液配制溶剂及样品制备用溶剂的选择

由于0.01mol/L的盐酸溶液的pH值为2.0，最接近流动相的pH值所以选择0.01mol/L的盐酸溶液作为考察的对象，并选择了甲醇∶盐酸（0.01mol/L）（7∶3）、甲醇∶盐酸（0.01mol/L）（6∶4）、甲醇∶盐酸（0.01mol/L）（5∶5）三个比例进行考察。发现在配制混合标准品储备液溶剂为甲醇∶盐酸（0.01mol/L）（7∶3）时混合标准品均完全溶解，而溶剂为甲醇∶盐酸（0.01mol/L）（6∶4）、甲醇∶盐酸（0.01mol/L）（5∶5）时混合标准品有部分未溶解，因此，选择甲醇∶盐酸（0.01mol/L）（7∶3）溶液作为混合标准品储备液配制溶剂。将其作为样品制备用溶剂，发现其也能很好地提取出7种待测组分，为了简化溶液的配制所以同时选择其作为样品制备用溶剂。

4.2 流动相条件的优化

为了解决检测时盐酸美满霉素色谱峰出现了双峰且盐酸多西环素与氯霉素的色谱峰的分离度不能达到1.5的问题，笔者将从流动相pH值、草酸溶液浓度、流动相中各成分比例以及是否采取梯度洗脱等方面对流动相条件进行优化。①在试验前的资料查询中发现，流动相的pH值会对七种组分的分离效果产生影响，pH值大于4时有些组分会出现严重的拖尾现象，pH值在2.0~3.0时7种组分可以较好的分离，但是流动相pH值在2.0左右时对色谱柱的损伤较大，所以流动相的pH值的考察选择在2.5~3.0。②为了解决盐酸美满霉素出现双峰的现象，笔者对草酸溶液的浓度进行了考察。③为了解决盐酸多西环素与氯霉素的色谱峰的分离度不能达到1.5的情况，笔者对流动相的比例和流速进行了考察。最后发现流动相为0.003 mol/L草酸溶液（磷酸调节pH至2.5）∶乙腈∶甲醇（70∶10∶20），流速为0.8 mL/min时色谱峰的峰形以及分离度都较好；④参考文献中多采用了梯度洗脱的方式，但是梯度洗脱液相色谱仪至少需要配置二元泵且梯度洗脱在试验过程中容易出现基线漂移的情况，在试验中发现不采用梯度洗脱的方式也能分离检测7种待测组分，所以还是选择固定流动相比例来检测。

4.3 20批样品中添加7种抗生素的情况分析

20批样品中购于正规化妆品连锁店的10批样品均未检出其中组分，购于网络（包括直播带货）的10批样品有一批样品检出了甲硝唑，含量为546.46 mg/kg且该批样品来源于直播带货平台，存在未标注生产许可证号且标注有禁止用语（医疗术语）的情况。现在不仅有淘宝、京东等电商平台，抖音、快手、拼多多等直播带货平台也日渐火爆，但是直播带货平台商品的质量较差，在日后的产品监督检测中应加大其产品的监督强度及频次。

5 结论

该试验方法对盐酸美满霉素等七种组分现行检测规范的检测方法进行了优化，从样品的前处理提取液浓度和比例、流动相pH值、流动相比例和流速、是否采取梯度洗脱等方面进行了试验条件的筛选。试验结果表明优化后的试验方法前处理简洁、灵敏度好、回收率高，能快速地对盐酸美满霉素等七种组分进行准确地分离和定量，可对膏霜类祛痘抗粉刺化妆品中的7种抗生素的含量进行测定。