15N示踪法研究生物炭施用对水稻—土壤系统氮肥去向的影响

陈照明，王 强，刘晓霞，林海忠，何 杰，俞巧钢，马军伟

(1.浙江省农业科学院环境资源与土壤肥料研究所，杭州 310021；2.浙江省耕地质量与肥料管理总站，杭州 310020；3.浙江省台州市黄岩区农业技术推广中心，浙江 台州 318020)

水稻(L.)是我国最重要的粮食作物之一，对保障国内粮食安全具有重要的意义。施用氮肥是提高水稻产量的主要手段。为追求水稻高产，农民往往施用大量的化肥，尤其是氮肥。然而，氮肥大量施用并未明显提高水稻产量，反而引起一系列环境问题，同时还会造成资源浪费。因此，如何在保证水稻产量的前提下提高水稻氮肥利用率同时减少氮肥损失，是目前水稻生产上亟需解决的问题。

生物炭是由有机物料在厌氧或无氧条件下经高温裂解制备而的固体。生物炭具有较高的碳含量，性状比较稳定，不易被土壤微生物分解。因此，生物炭施入土壤中可以改善土壤物理化学性状，提高土壤肥力。此外，生物炭还具有丰富的多微孔结构和较大比表面积的特点，可以吸附固定肥料，进而提高养分利用率,减少肥料损失。有研究表明，施用生物炭能够提高作物产量，改善土壤状况，提升土壤肥力。张爱平等采用田间试验发现，与只施氮肥处理相比，生物炭配施氮肥显著提高水稻产量，且产量随生物炭施用量增加而增加。但是Liu等认为，施用生物炭对于水稻增产的作用很有限。这是因为生物炭对水稻产量的影响受生物炭种类、土壤类型、施用年限及气候条件等因素的影响。此外，生物炭对水稻氮素吸收影响的研究也存在矛盾的地方。有研究认为，由于生物炭含碳量高，施入土壤后促进微生物对氮的固持，从而减少作物对氮素的吸收，最终导致作物减产。然而，陈曦等研究认为，施用生物炭可以提高稻田土壤的铵态氮和硝态氮含量，满足水稻生长发育的氮素需求。

目前国内外对生物炭施用下水稻产量、氮肥利用率、土壤肥力的影响的研究较多，然而对于施用生物炭对肥料氮在土壤—水稻系统中定量分配相关研究还不多。因此，探明水稻秸秆生物炭施用对水稻氮肥利用率、氮肥残留及损失的影响，对于水稻氮肥高效利用具有重要意义。本研究利用稳定同位素(N)示踪技术研究水稻秸秆生物炭使用对肥料氮在水稻—土壤系统中去向的影响，旨在为水稻绿色生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采集自浙江省台州市，当地主要种植方式为水稻—西兰花轮作。在西兰花收获后取0—20 cm耕层土壤，自然风干后过2 mm筛，备用。该区域土壤为滩涂土壤，成土母质为新浅海沉积物。供试土壤的基本理化性质为：pH 7.3，有机质含量37.2 g/kg，全氮含量1.3 g/kg，碱解氮含量160.5 mg/kg，有效磷含量23.6 mg/kg，速效钾含量185.1 mg/kg。供试生物炭以水稻秸秆为原料，在厌氧条件下经500 ℃高温裂解而成。水稻秸秆生物炭的基本理化性质为：pH 9.4，有机碳含量670.0 g/kg，全氮含量14.2 g/kg。供试水稻品种为“甬优1540”，由宁波种子有限公司提供；供试N标记的氮肥为尿素(46% N，丰度10.15%)，由上海化工研究院提供；供试磷、钾肥分别为过磷酸钙(12% PO)和氯化钾(60% KO)，市售。

1.2 试验设计

试验于2020年7—11月在浙江省农业科学院环境资源与土壤肥料研究所温室内进行。试验共设置5个处理：(1)不施氮肥(N0)；(2)单施化肥(CF)；(3)施肥+施用0.5%生物炭(BC1)；(4)施肥+施用1%生物炭(BC2)；(5)施肥+施用2%生物炭(BC3)。每个处理重复3次。采用塑料桶(直径20 cm，高20 cm)进行盆栽试验。每桶装入过2 mm筛的土壤6 kg(干重)。对于N0处理，磷钾肥作基肥一次混匀施用；对于剩余4个处理(CF处理和施用生物炭处理)，氮肥分2次施用(基肥∶穗肥为5∶5)，磷钾肥作基肥一次施入。处理2～处理5的氮肥、磷肥和钾肥施用量一致，分别为N 180 mg/kg干土、PO50 mg/kg干土和KO 120 mg/kg干土。相应的肥料、生物炭和土壤混匀后，填入桶中；随后加入蒸馏水，使土壤保持淹水状态，平衡2天后进行水稻移栽，每盆移栽2株。在水稻整个生育周期，除晒田期和收获前1个星期，桶内田面水保持3～5 cm高度。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 植株样品采集及N丰度测定 在水稻成熟后采集植株样品，将水稻植株样品分为籽粒、秸秆和根三部分。新鲜植株样品在烘箱内105 ℃下杀青30 min，然后在70 ℃下烘至恒重，测定干物质质量。烘干的水稻样品粉碎后过0.15 mm的筛子，备用。籽粒和秸秆的全氮与N丰度采用元素分析仪(Costech ECS 4024，Costech分析技术公司，意大利)耦合同位素质谱仪(Delta V Advantage，赛默飞世尔科技公司，美国)进行测定。

1.3.2 土壤样品采集及N丰度测定 在水稻样品采集后，将塑料桶内土壤全部倒出混合均匀，取50 g土壤样品，样品分为2部分：一部分置于室内自然风干，剩余部分土壤样品保存在-20 ℃冰箱里，用于DNA的提取。风干后的土壤样品研磨后过0.15 mm筛子，用于全氮和N丰度的测定。土壤全氮和N丰度采用元素分析仪(Costech ECS 4024，Costech分析技术公司，意大利)耦合同位素质谱仪(Delta V Advantage，赛默飞世尔科技公司，美国)进行测定。

1.3.3 土壤总DNA提取及实时荧光定量PCR 称取0.5 g新鲜土壤，利用Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒，按照说明书来提取土壤总DNA。使用CFX96 Real-Time System(Bio-Rad Laboratories, USA)进行定量PCR(qPCR)。氨氧化细菌的引物序列为amoA-1F(GCGGGTTTCTACT-GGTGGT)和amoA-2R(CCCCTTCGGGAAAGCCTTCTTC)；氨氧化古菌的引物分别为crenamoA23f(ATGGTCTGGCTWAGACG)和crenamoA616r(GCCATCCATCTGTATGTCCA)。qPCR的反应体系为20 μL：包含10 μL的SYBR Premix Ex Taq(Takara Biotechnology，日本)、各0.3 μL的正向和反向引物、1 μL的模板和8.4 μL的灭菌水。阴性对照采用灭菌水作为模板。每个样品重复3次。

1.4 计算公式

氮肥表观利用率、氮肥利用率、氮肥残留率及损失率等相关指标计算公式为：

氮肥表观利用率(%)=(施氮区植株总氮积累量-不施氮区植株总氮积累量)/施氮量×100%

植株氮素来自肥料氮的比例(%)=(植株N丰度-0.366)/(氮肥N丰度-0.366)×100%

植株中来自肥料的氮量(g/盆)=植株氮积累量×植株氮素来自肥料氮的比例/100

氮肥利用率(%)=植株吸收的肥料氮量/施氮量×100%

土壤中氮肥残留量(g/盆)=土壤全氮含量×土壤干重×(土壤N丰度-0.366)/(氮肥N丰度-0.366)/1000

氮肥残留率(%)=土壤中氮肥残留量/施氮量×100%

氮肥损失量(g/盆)=施氮量-植株吸收的肥料氮量-土壤中肥料氮残留量

氮肥损失率(%)=氮肥损失量/施氮量×100%

1.5 数据分析

试验数据采用Excel 2016进行整理，采用SPSS 20.0软件进行统计分析，以Duncan法进行多重比较，差异显著性水平为<0.05。

2 结果与分析

2.1 施用水稻秸秆生物炭对水稻生物量的影响

由表1可知，施用氮肥显著提高水稻产量、秸秆生物量和总生物量。与CF处理相比，施用1%生物炭(BC2)和2%生物炭(BC3)分别增加水稻产量19.3%和22.0%；而BC1处理对水稻产量没有显著影响。BC1处理的水稻秸秆生物量最高，且显著高于CF处理、BC2处理和BC3处理。施用生物炭处理相较于常规施肥处理提高水稻根生物量60.0%～95.0%。施用生物炭的水稻总生物量为79.2～82.8 g/盆，均显著高于常规施肥处理(CF)。

表1 施用生物炭对水稻籽粒产量、秸秆、根及总生物量的影响 单位：g/盆

2.2 施用水稻秸秆生物炭对水稻氮素累积的影响

由表2可知，施用氮肥显著提高水稻籽粒、秸秆、根及总的氮素累积量。生物炭施用处理的籽粒氮素积累量为0.50～0.52 g/盆，且均显著高于CF处理(0.42 g/盆)。BC1处理的秸秆氮素积累量最高，且显著高于其他处理；但是剩余施肥处理间(CF、BC2和BC3处理)没有显著差异。与常规施肥相比，生物炭施用显著增加水稻根系的氮素积累量。生物炭施用处理(BC1、BC2和BC3)的总氮素积累量分别为0.76，0.69，0.70 g/盆，较CF处理分别增加28.6%，16.3%，18.1%。施用生物炭相较于CF处理氮肥表观利用率增加38.9%～68.4%。

表2 施用生物炭对水稻氮素积累量和氮肥表观利用率的影响

2.3 施用水稻秸秆生物炭对水稻肥料氮和土壤氮吸收的影响

由表3可知，施用生物炭处理相较于CF处理显著提高了籽粒对肥料氮的吸收；对土壤氮的吸收也有所提高，但未达到显著水平。对于水稻秸秆肥料氮和土壤氮的吸收，均是BC1处理最高，且显著高于其他处理。高量生物炭处理(BC3)的根系肥料氮吸收量显著高于CF处理，但低量和中量生物炭处理(BC1和BC2)与CF处理之间无显著差异。生物炭施用处理(BC1、BC2和BC3)的水稻根系土壤氮吸收量为0.016～0.017 g/盆，高于CF处理的0.009 g/盆。与CF处理相比，BC1处理显著促进水稻对土壤氮的吸收。然而，BC2和BC3处理的水稻中总土壤氮吸收量与CF处理均无显著差异。

表3 施用生物炭对水稻肥料氮和土壤氮吸收的影响 单位：g/盆

2.4 施用水稻秸秆生物炭对肥料氮去向的影响

从表4可以看出，施用生物炭的氮肥利用率分别为30.4%，28.5%和29.3%，均显著高于CF处理的24.1%。37.5%～45.8%的氮肥残留在土壤中，且与CF处理相比，施用生物炭(BC1处理除外)显著提高土壤中肥料氮的残留量和残留率，这说明施用生物炭有较好的保肥性。CF、BC1、BC2和BC3处理的氮肥损失量分别为0.41，0.30，0.28，0.28 g/盆。施用生物炭处理相较于CF处理氮肥损失率降低28.5%～33.0%。

表4 施用生物炭对肥料氮(15N)去向的影响

2.5 施用水稻秸秆生物炭对氨氧化微生物的影响

从图1可以看出，氨氧化细菌(3.7×10～6.8×10/g干土)的基因拷贝数高于氨氧化古菌(1.5×10～2.7×10/g干土)。与CF处理相比，B3处理显著降低氨氧化细菌的基因拷贝数，但B1和B2处理对氨氧化细菌基因拷贝数没有显著影响。施用生物炭处理(BC1、BC2和BC3)与CF处理间的氨氧化古菌基因拷贝数没有显著差异。CK处理与CF处理之间的氨氧化微生物丰度没有显著差异。

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

生物炭在农业生产上已有广泛的应用，但应用效果不尽相同。有研究表明，施用生物炭可以促进水稻生长，提高水稻产量。也有报道认为，施用生物炭不会提高水稻产量，甚至还可能引起水稻减产。这是因为生物炭对水稻产量的影响会受土壤类型、生物炭种类、生物炭施用年限、气候等因素的影响。有研究认为，生物炭具有较高的C/N，施入土壤后会引起土壤速效氮的微生物固持，从而影响水稻早期生长发育养分供应不足，最终引起减产。结果表明，施用生物炭处理比单施化肥处理增加9.9%～22.0%的水稻产量(表1)。类似地，Dong等采用田间试验研究发现，与单施尿素相比，尿素配施生物炭显著提高水稻产量12.9%。生物炭能够改善土壤环境、提高土壤养分含量、促进水稻生长，从而提高水稻产量。眭锋等认为生物炭通过影响稻田土壤氮素有效性，从而影响水稻的产量。

本研究显示，施用水稻秸秆生物炭显著增加水稻籽粒氮素积累量和总氮积累量。张爱平等对宁夏引黄灌区水稻研究发现，施用生物炭配施尿素相较于单施尿素显著提高水稻地上部总吸氮量，且随生物量施用量增加而增加；向伟等也研究认为，与施用化肥处理相比，施用化肥配施10 t/hm生物炭显著增加水稻总吸氮量10.2%～10.4%，使得施用生物炭处理的氮肥表观利用率显著高于单施化肥处理。在本研究中，施用生物炭处理的氮肥表观利用率为31.2%～38.6%，显著高于CF处理的22.9%(表2)，这与张爱平等研究结果一致；同时韩晓日等研究发现，施用生物炭显著提高玉米氮肥表观利用率。此外，笔者采用N示踪技术研究发现，施用生物炭显著促进水稻对肥料氮的吸收。这可能的原因是生物炭具有多孔结构，还具有较大的比表面积，前期能够固定铵态氮和硝态氮，后期可以释放无机氮供作物吸收利用，从而提高氮肥利用率。同时，结果显示生物炭处理的AOB基因拷贝数低于CF处理。施用生物炭还可能通过降低AOB丰度来抑制土壤硝化作用，从而减少氮肥损失，最终提高水稻氮肥利用率。Wang等研究认为，施用生物炭能够降低AOB丰度和多样性而抑制土壤硝化作用，从而促进作物生长和氮肥利用。王鸿浩等研究发现，施用生物炭显著降低AOB丰度，但提高基因丰度，从而减少稻田土壤NO排放损失。本研究还证明施用生物炭提高肥料氮在土壤中的残留，起到保肥的效果。

在本研究中，对于施用生物炭处理，采用差减法得到的氮肥表观利用率(31.2%～38.6%)高于N示踪法计算得到的(28.5%～30.4%)；然而，在CF处理中，2种方法计算得到的氮肥利用率相似。这说明施用生物炭促进肥料氮(N)的吸附固持，同时也促进土壤氮的矿化。固持的肥料氮在水稻生长发育过程中能不断释放出来供水稻吸收利用，从而提高水稻中肥料氮的积累量。施用生物炭还可通过吸附铵态氮来减少稻田氨挥发损失，从而提高氮肥利用率。此外，本研究还显示，施用生物炭有增加水稻对土壤氮吸收利用的趋势(表3)。当然，水稻所吸收的未标记N中可能有一小部分来自水稻秸秆生物炭。但是，Xie等利用N标记的小麦秸秆生物炭进行盆栽试验研究表明，生物炭中所含的氮素生物有效性极低，仅有2%能被水稻吸收利用。本研究表明，与CF处理相比，施用生物炭显著降低氮肥损失率。许堃等研究发现，施用生物炭相较于不施用生物炭显著提高油菜中肥料氮的积累量，减少肥料氮的损失。生态碳具有的孔隙结构可以延长肥料氮的释放，以供作物吸收利用，提高氮肥利用、减少氮肥损失。Huang等采用N示踪技术研究发现，与单施化肥处理相比，施用生物炭减少氮肥损失率9～10个百分点。

4 结 论

(1)施用水稻秸秆生物炭相较于单施化肥可以提高水稻产量，增产率为9.9%～22.0%，且较高生物炭施用量(1%和2%)的增产效果更明显。

(2)施用生物炭不仅提高水稻氮素积累量，还提高氮肥表观利用率。与单施化肥处理相比，施用生物炭促进水稻对肥料氮的吸收，提高肥料氮的利用率。

(3)施用水稻秸秆生物炭还增加肥料氮在土壤中的留存，同时显著降低氮肥的损失率。

(4)施用生物炭可能通过降低氨氧化细菌的丰度来抑制土壤硝化作用，从而减少氮肥损失，提高氮肥的作物吸收利用，不过该机制还需进一步进行研究。