不同粒径珍珠粉透皮吸收的研究

童银洪，刘 永，纪德安，肖松丰，高 平

（1广东海洋大学珍珠研究所，广东湛江 524025；2湛江海洋大学珍珠有限公司，广东湛江 524025；3湛江市食品药品检验所，广东湛江 524022）

珍珠是珍珠分泌细胞形成的，由95%左右的生物碳酸钙和5%左右的有机质组成，其中有机质包含多种生物活性物质，如:蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、类胡萝卜素、牛磺酸和微量元素等[1-2]。珍珠粉是将珍珠粉碎、磨细而成的粉状物。我国已有2000 多年珍珠粉的使用历史，珍珠粉可用于内科、外科、妇科、儿科、五官科、皮肤科等护肤、保健和医药行业，具有润肤祛斑、解毒生肌、安神定惊和明目消翳等功效[3-4]。近年来珍珠粉用于压疮护理、骨损修复、免疫调节和改善产后切口愈合等方面，受到医药行业的广泛关注[5-9]。

近年来中外许多学者开展了珍珠的体外抗氧化性和美白机理研究，证实珍珠具有抗衰老的护肤功效[10-16]。市场上珍珠粉种类繁多，从粒径大小角度可分为普通、超细和纳米级。人体皮肤的毛孔很细小，一般来说，珍珠粉颗粒粒径越细，其生物活性物质就越容易渗透到肌肤底层，促进皮肤新陈代谢、增强细胞活力，从而起到延缓衰老的作用。

目前珍珠粉透皮吸收的研究很少，只有杨安全等[17]比较了纳米级与微米级珍珠粉的透皮吸收，两种具有显著性差异，纳米级珍珠粉的经皮渗透速度明显快于微米级珍珠粉。但没有研究珍珠粉的粒径分布和矿物组成，难以深入比较透皮吸收效果，不利于珍珠粉加工技术的改进与提高。珍珠粉生产厂家由于原料、加工设备、加工工艺和检测技术等不同，珍珠粉的粒径分布千差万别。若珍珠粉不能被吸收或者吸收不充分，功效则难以达到，还会造成皮肤的负担。因此，研究不同粒径珍珠粉的透皮吸收，具有理论和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三种不同粒径的珍珠粉由海南某珍珠公司提供，经过激光粒度分析仪检测平均粒径为0.3 μm、3 μm、10 μm，分别编号为样品1、样品2 和样品3 号。

采用扫描电子显微镜（GeminiSEM 300 型，加速电压为5kV）对三种不同粒径的珍珠粉进行微观形貌观察。

采用X 粉末衍射仪（PANalytical X’Pert PRO型，铜靶，波长=0.154 nm）检测三种珍珠粉样品的物相组成。

采用红外光谱仪（美国NEXUS 470 FT-IR 型）对三种珍珠粉进行红外光谱分析，测试条件：KBr压片法，扫描范围2000～400 cm-1，扫描次数32次，分辨率为4 cm-1。

1.2 试剂与仪器

配制pH=5 纯净水：称取14.7 g 柠檬酸溶于700 mL 纯净水中，配成溶液A；称取29.4 柠檬酸三钠溶于1000 mL 纯净水中，配成溶液B；将615 mL溶液A 与885 mL 溶液B 混合后，再加入1500 mL纯净水，测定pH 为5，常温保存备用。

分别称取0.3 μm、3 μm、10 μm 珍珠粉9 mg，转移至50mL 容量瓶中，加pH=5 纯净水定容至刻度，均为澄清溶液，静置24 h 无沉淀析出，常温保存备用。称取无水氯化钙粉末28 mg，转移至50 mL容量瓶中，加pH=5 纯净水定容至刻度，溶液澄清，常温保存备用。

试验动物：KM 小鼠，20±2 g，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SCXK（湘）2019-0004，合格证号：1107272011006880。使用许可证号：SYXK（桂）2019-0001。

主要试剂：纯净水；Ca 试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20200721）；无水氯化钙（上海超强化工有限公司，生产批号：151101），一水合柠檬酸（国药集团化学试剂有限公司，生产批号：20120131），二水合柠檬酸三钠（国药集团化学试剂有限公司，生产批号：20120118）。

主要仪器：TP-6 智能透皮试验仪（天津市精拓仪器科技有限公司），是一种渗透扩散装置，如图1所示。渗透扩散装置由上下两筒状玻璃对合，皮肤夹于两室之间，上为扩散室，下为接收室，接受室的两侧有入口管和出口管，供取液和补充接受液之用；ME204E 分析电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Infinite M200PRO 酶标仪（Tecan，瑞士）。紫外可见分光光度计（UV754N，上海佑科仪器仪表有限公司）。

图1 渗透扩散装置的示意图

1.3 实验方法

小鼠离体无毛皮肤的制备：用电动剃毛器将小鼠腹部剃毛后，用脱毛膏进行脱毛处理，生理盐水洗净腹部脱毛部位，饲养24 h 后处死，剥离无毛的腹部皮肤，去除皮下脂肪，用生理盐水洗干净后滤纸吸干水分，剪成适当大小的圆形（直径约3cm），再用pH=7.4 的磷酸盐PBS 缓冲液漂洗干净，滤纸吸干备用。

体外透皮试验：取30 块小鼠皮肤，雌雄各半，随机分为5 个组（分别为空白组、阳性组、浓度为0.18 mg/mL 的0.3 μm、3 μm、10 μm 珍珠粉组），每组6 块。利用TP-6 智能透皮试验仪，扩散池的有效面积约为1.54 cm2，接受介质为pH=5 纯净水，接受池的体积约为13.5 mL。将处理好的小鼠离体无毛皮肤固定于扩散池和接受池之间，角质层表面朝向扩散池，在扩散池中加入待测珍珠粉，用保鲜膜覆盖扩散池顶部及接受池取样口，在350 r/min、（37±0.5）℃的条件下，分别于1、2、4、6、8、10、12、24 h 时从接受池中取样0.4mL，置于0.5mL 离心管中保存待测，每次取样后补加等量等温的pH=5纯净水。采用紫外可见分光光度计测定钙离子含量。

钙含量及其累计渗透量：

式中：OD 值为吸光度，无量纲。标准品浓度：5.04mmol/L

累积透过量：按照公式计算单位面积累积渗透量（Q）

式中：S为有效面积，1.54 cm2；V0为接受池中接收液体积，13.5 mL；V为取样体积，0.4 mL；Ci为第i 次取样时接收液中碳酸钙质量浓度，mg/mL〔0.1×钙含量（mmol/L）〕；Cn为第n次取样时接收液中碳酸钙质量浓度，mg/mL〔0.1×钙含量（mmol/L）〕；n为取样次数。以累积透过量为纵坐标，时间为横坐标，绘制三种粒径珍珠粉透皮吸收曲线。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜下特征

整体上，样品1 的颗粒粒径最小，但团聚一起；样品2 的颗粒粒径居中，分布均匀；样品3 的颗粒粒径最大，差异也大，分布不均匀。如图2 所示。

图2 珍珠粉的扫描电镜SEM 二次电子像（上-样品1，中-样品2，下-样品3）

2.2 X 射线粉末衍射（XRD）分析

如图3 所示，三个样品的衍射峰位置与文石型碳酸钙（标准PDF 卡片No.71-2396）的衍射峰位置一致[18]，表明三种珍珠粉的矿物组成主要为文石型碳酸钙；样品2 和样品3 在衍射角2θ=29.4°位置有极弱的方解石（hkl=104）晶面的衍射峰，表明含有痕量方解石型碳酸钙。

图3 不同粒径珍珠粉的XRD 图谱

2.3 傅里叶红外光谱（FT-IR）分析

如图4 所示，三个样品分别在1790cm-1、1448cm-1、1081 cm-1、860 cm-1、712 cm-1位置出现明显吸收峰。其中1790 cm-1处吸收峰对应的是C-O 伸缩振动峰，1448 cm-1处对应的是C-O 不对称伸缩振动峰，在1081 cm-1处出现的吸收峰对应的是C-O 对称伸缩振动峰，在860 cm-1处对应的是CO32-面外变形振动峰，在712 cm-1处吸收峰对应的是CO32-面内变形振动峰，这与文石型碳酸钙的红外光谱图相对应[19]。

图4 不同粒径珍珠粉的FT-IR 图谱

X 射线粉末衍射谱和红外光谱的测试结果表明，三种珍珠粉的矿物成分主要为文石型碳酸钙，样品2 和样品3 含有痕量方解石型碳酸钙。

2.4 三种粒径珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量

三种粒径珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量结果以X±S表示，如表1 所示。在三种粒径珍珠粉中，1、2、4、6、8、10、12、24 h 时平均粒径10 μm珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量最低。1、2、6、8 h时平均粒径0.3 μm 珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量高于平均粒径3 μm 珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量；4、10、12、24 h 时平均粒径3 μm 珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量高于平均粒径0.3 μm 珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量。

表1 三种粒径珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量（，n=6）

表1 三种粒径珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量（，n=6）

2.5 三种粒径珍珠粉中碳酸钙经皮渗透速率

以累积渗透量为纵坐标，时间为横坐标，绘制经皮渗透曲线，如图5 所示。平均粒径0.3 μm 珍珠粉：Q=0.0055t+0.2778（n=6，r=0.6083），经皮渗透速率为0.0055 mg·cm-2·h-1。平均粒径3 μm 珍珠粉：Q=0.0089t+0.2506（n=6，r=0.8840），经皮渗透速率为0.0089 mg·cm-2·h-1。平均粒径10 μm 珍珠粉：Q=0.001t+0.2118（n=6，r=0.3734），经皮渗透速率为0.001 mg·cm-2·h-1。

图5 不同粒径珍珠粉中碳酸钙经皮累积渗透量曲线

不同粒径珍珠粉在不同时间透皮钙含量如图6所示，0.3μm 珍珠粉24h 碳酸钙的累积渗透量为（0.382±0.118）mg·cm-2；3μm 珍珠粉24h 碳酸钙的累积渗透量为（0.433±0.198）mg·cm-2；10 μm 珍珠粉24 h 碳酸钙的累积渗透量为（0.244±0.226）mg·cm-2。0.3 μm 珍珠粉经皮渗透速率为0.0055 mg·cm-2·h-1；3 μm 珍珠粉经皮渗透速率为0.0089 mg·cm-2·h-1；10 μm 珍珠粉经皮渗透速率为0.001 mg·cm-2·h-1。

图6 不同粒径珍珠粉在不同时间透皮钙含量

三种不同粒径珍珠粉中碳酸钙经皮渗透速率及24 h 皮肤渗透累积量的大小为：3 μm＞0.3 μm＞10 μm。

3 结论与讨论

三种珍珠粉中主要成分为文石型碳酸钙，是一种生物活性钙。此外，珍珠粉还有少量有机质（蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、类胡萝卜素和牛磺酸等活性成分），碳酸钙与有机质结合成在一起。随着碳酸钙的经皮渗透，有机质也经皮渗透进入皮下组织，产生功效性作用。三种不同粒径珍珠粉中活性成分经皮渗透速率及24 h 皮肤渗透累积量的大小为：3 μm＞0.3 μm＞10 μm。3 μm 粒径珍珠粉透皮吸收效果最好，主要原因为粒径分布均匀、粒径大小合适。

珍珠层一般是由碳酸钙晶质薄层与有机质的薄层交替累积而成。碳酸钙单晶长3～5 μm，宽2～3 μm，厚0.2～0.5μm，为不规则多边形的扁平平板状，由有机质粘结，有机质厚约0.1～0.3μm 。整个珍珠层结构好像“砖墙”结构，由一层的“砖块”（碳酸钙）加上一层“泥灰”（有机质）经重叠为上千层累积而成[20-21]。采用现代加工工艺，尽可能将碳酸钙晶体与有机质完全解离，使得珍珠有效成分能直接、快速和均匀地被皮肤吸收利用，是珍珠化妆品开发的重点和方向[22]。

为了提高珍珠粉的吸收效率，在粉状珍珠面膜中可加入适量熟石膏，熟石膏溶于水时可释放热量，使皮肤温度微微升高，促进血液循环，促进皮肤对有效成分的吸收；在膏状珍珠面膜中可加入适量成膜物质，在产品使用过程中使皮肤与外界空气隔绝，皮肤温度会上升，膏状面膜中珍珠的营养活性成分会更快地渗进皮肤内层，促进表皮组织细胞的增殖生长、分裂，重组皮肤内层，促进皮肤新陈代谢，起到明显的护肤作用[23]。

添加促进剂有利于珍珠粉的透皮吸收。皮肤角质层作为一种生物屏障限制了很多营养活性物质的经皮渗透，因此采用有效的方法促进营养活性物质经皮渗透成为技术关键。聚合物纳米粒因具有药物包封率高、减小酶降解、可控释性能好、比表面积大等优势，易于在皮肤表面富集，从而促进活性物质渗透和功效显现；此外，珍珠粉与氧化锌等粉末混合，发挥联合协同作用，可以有效治疗皮肤病，已成为近几年的研究热点[24-25]，应引起珍珠化妆品和医药行业的高度重视。

化妆品的功效越来越受到消费者重视，而化妆品是否能透皮吸收是其发挥真正功效的前提。大多数情况下珍珠粉在使用时会与水混合或者添加到乳液、膏霜中，很少单独使用，珍珠美白、保湿和延缓衰老等护肤功效成分的开发与应用，需要建立在透皮吸收的基础上，扩散池法是目前最常用的检测化妆品成分透皮吸收的体外方法[26]。本研究采用扩散池法比较不同粒径的珍珠粉透皮吸收效果，使用小鼠离体无毛皮肤在体外进行，是在一定的实验环境条件下得出的结论，对珍珠粉的加工与应用具有指导意义。实际上，人体皮肤是一个复杂的动态的有机系统，不同个体存在差异性，而且影响吸收效果的皮肤因素很多，如年龄、性别、皮肤部位、温度和完整性、角质层含水量等等。本研究没有深入涉及珍珠粉的透皮吸收机理，不同粒径的珍珠粉末溶于水后的物理和化学性质的变化是否一致，CaCO3是否已经发生了同样的电离反应，尚有待今后加强研究。