鸡毒支原体MG荧光定量PCR技术评估实验室MG核酸污染方法

2022-04-05 13:48张承新张鹏彭晓艳王海兰曲秀娟姜皓卢艳慧李新郭龙宗李玉燕
家禽科学 2022年3期

张承新 张鹏 彭晓艳 王海兰 曲秀娟 姜皓 卢艳慧 李新 郭龙宗 李玉燕

摘 要:为了评估鸡毒支原体(MG)非免疫鸡群的MG感染,常采用MG荧光定量PCR技术进行监测;而在鸡群的MG净化监控前,需要对实验室进行MG核酸污染评估,无污染后才能进行后续的净化检测工作。本实验采用MG荧光定量PCR技术评估实验室各区域的MG核酸污染情况,如果存在核酸污染,需要采取一系列的消毒措施,直至实验室MG核酸污染监控为阴性。

关键词:鸡毒支原体;荧光定量PCR;核酸污染

中图分类号:S858.31 文献标识码:B 文章编号:1673-1085(2022)03-0060-03

荧光定量PCR(real-time PCR),是一种使用荧光定量PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。与常规PCR技术比较,荧光定量PCR可以对起始模板准确定量,能够对扩增反应实时检测;而常规PCR不能。根据荧光收集的机制,荧光定量PCR分为探针法和染料法;本研究采用探针法MG荧光定量试验评估实验室MG核酸污染。

1 材料与方法

1.1 试验仪器及试剂

ABI Q5荧光定量PCR仪(QuantStudioTM 5 Real-Time PCR Instrument);RealPCR 败血性支原体/DNA检测混合液,购自IDEXX公司,批号:44B1045,有效期至2022年8月8日。

1.2 采样方法

在1.5 mL离心管中加入适量PCR级水,将植绒拭子浸入离心管中,在离心管壁上挤压,去除多余的水,之后用拭子对实验室各功能间环境样品进行采样;在取样区旋转擦拭2~3次,再将拭子放回离心管中,旋涡震荡混匀,洗脱拭子上的核酸;挤压后拭子弃掉,离心管中液体作为荧光定量PCR待检样品。

1.3 采样区域

根据实验室的布局和实验区域划分,用不同的拭子对每个待检测污染监控区域进行取样,并进行编号。实验室采样区域见表1。

1.4 实验方法

参照试剂盒说明书进行操作,总反应体系为25 μL:目标检测预混液10 μL,DNA扩增预混液10 μL,样品DNA 5 μL。

扩增程序:50 ℃ 15 min,95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s ;共45个循环。

2 荧光定量PCR检测结果

实验有效标准:阳性对照FAM Ct值<38,HEX(VIC)<38;PCR阴性对照FAM Ct值无信号,HEX(VIC)≥36。

根据实验室环境采样区域荧光定量PCR检测结果显示:在MG疫苗株或者野毒样品检测后,样品制备室和基因扩增室存在不同程度的MG阳性核酸污染,而试剂制备室为洁净区,未检测到MG阳性核酸污染。实验室环境采样区域荧光定量PCR检测结果见表2。

3 防控措施

3.1 核酸污染去除措施

针对MG阳性核酸污染区域,使用84消毒液或其他含氯消毒液进行消毒处理,使用工作浓度有效氯含量高于2 000 mg/L,可以用试纸条进行浓度含量测定。

污染工作台处理方法:用84消毒液作用5~10 min,再用75%酒精擦拭2~3遍;污染移液器及提取仪等仪器处理方法:用75%酒精擦拭2~3遍;污染功能间与超净台:同时用紫外灯照射30 min。之后再按照操作1的试验方法继续进行环境采样评估,若仍存在核酸污染,按照3.1措施继续进行消毒处理,直至核酸污染彻底清除。

3.2 核酸污染预防措施

3.2.1 制定科学完善的操作规程 为了预防核酸污染问题,首先根据实验室功能,进行分区管理,针对每个实验功能区制定详细的操作流程及技术规范。根据日常核酸污染监控结果,对容易忽略的方面,进行及时补充修订,确保操作规程简单、有效且具有较强操作性。

3.2.2 实验室人流、物流严格控制 人员进入各功能区缓冲间后须更换衣服、拖鞋,每个实验功能区的衣服颜色或款式要求不同,专人专鞋,防止交叉污染。进出各功能区需进行手部消毒,实验前配套手套、口罩。工作服每周用84消毒液进行浸泡清洗。各实验功能区的耗材禁止串用,各区域的垃圾桶、卫生清洁工具、记号笔、移液器等采用颜色管理,不得混用。各功能区须配备相应的去污染消毒试剂,84消毒液、75%酒精喷壶等。工作人员在清洁时按照工作区流程进行,不得逆行。

3.2.3 規范实验室废弃物处理 试验用移液器枪头、试验结束后的提取及PCR耗材先用84消毒液浸泡,再进行密封后丢弃。口罩、手套等浸泡84消毒液后丢弃,丢弃物及时进行清理。