环保试剂聚羟基丙烯酸和Van-clear用于HE染色效果分析

张淑艳，康林，张秀智，徐明堂，马晓丽

苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法是石蜡切片技术中较常用的染色法之一，苏木精（H）染液主要使细胞核内的染色质以及细胞质内的核酸着紫蓝色，伊红（E）主要使细胞质以及细胞外基质中的成分着红色［1］。及时、准确地固定、透明、脱蜡处理是HE 染色过程中的关键步骤，目前病理学界中主要采用甲醛和二甲苯来处理标本切片，但有研究指出甲醛和二甲苯具有刺激性，病理工作者又需要长期接触这两种试剂，长此以往容易对病理工作者的身体健康造成严重影响［2-3］。因此，寻找环保、安全性高的固定液和透明脱蜡液就显得尤为重要。本研究运用环保试剂聚羟基丙烯酸和Vanclear共同代替甲醛和二甲苯处理切片，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集河北省人民医院2018 年1 月至2019 年1 月期间送检的脑组织（12 例颞叶癫痫病人病变组织）、脾组织（18 例脾功能亢进病人病变组织）、骨髓瘤组织（22 例）、淋巴结组织（50 例肺癌/胃癌手术中切除的淋巴结标本）、淋巴瘤组织（10 例）、乳腺纤维腺瘤组织（62 例）、宫颈腺癌组织（26 例）、子宫平滑肌瘤组织（74 例）、慢性宫颈炎组织（102例）、胎盘组织（35 例子痫前期病人）、脂肪瘤组织（57 例），病人年龄范围18.7～70.5 岁，年龄（41.8±5.2）岁。同一部位标本各取材两块，采用抽签法随机分为A 组和B 组。A 组采用环保试剂聚羟基丙烯酸和Van-clear 制作HE 切片468 张，B 组采用传统甲醛和二甲苯制作HE切片468张，病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试剂与设备聚羟基丙烯酸固定液购自于广州艾发生物医学技术工程有限公司，Van-clear 环保透明脱蜡剂购自于上海创讯医疗器械有限公司，甲醛溶液购自于上海一基实业有限公司，二甲苯购自于上海一基实业有限公司，苏木精染液、伊红染液购自于上海谨生生物科技有限公司。SAKURA Tissue Tek VIP-5全自动密闭式组织脱水机、DRS-2000J-D2全自动染色机产自于日本樱花检验仪器株式会社，Thermo HM325 轮转石蜡切片机产自于德国Thermo公司，切片厚度为2～3μm，BJ43-PAS8000病理图像分析仪产自于北京市中西集团公司，OLYMPUSB×51荧光显微镜产自于日本奥林巴斯株式会社。

1.3 组织处理和制作切片A 组采用4%的中性缓冲甲醛液固定，经全自动组织脱水机脱水、二甲苯透明、浸蜡等处理，B 组采用聚羟基丙烯酸固定液固定，经全自动组织脱水机脱水、Van-clear 透明、浸蜡等处理。过程中注意固定液的量需达到标本体积的10倍，标本固定12 h后取材。

1.4 HE 染色A、B 组标本分别经过二甲苯或Vanclear 脱蜡处理之后，采用100%乙醇×2 各3 min，流水冲洗；苏木精染色12 min，流水冲洗；1%的盐酸乙醇分化数秒，水洗；1%氨水返蓝，水洗；1%醇溶性伊红染色1 min，70%乙醇各30 s，95%乙醇×2 各30 s，100%乙醇×2 各2 min，Van-clear 或二甲苯×2 各2 min，最后中性树胶封固。操作过程中相关病理组织处理流程和时间均严格按照中华医学会病理学会病理技术的相关规定和流程进行［4］，两组组织切片的HE 染色均在相同的条件中进行，以减少研究结果的误差，提高可信度。

1.5 HE 结果判断和评分根据中国常规病理切片质控中心推荐的质控评分标准［5］判断两组切片HE染色情况，判断的内容主要包括切片的脱蜡度、透明度、着色度、颜色鲜亮度等，采用优、良、中、差对切片的染色结果进行评定：优，切片的脱蜡度好、透明度好、着色度适中、颜色鲜亮度好；良，切片中组织染色程度较好，存在少量背景；中，切片中组织染色程度一般，存在大量背景；差，切片中组织染色程度差甚至未染色。

1.6 统计学方法用SPSS 21.0 对数据进行统计学分析。以率和百分比描述切片HE 染色结果的优良率，采用χ2检验比较，P＜0.05 表示差异有统计学意义。将A组的HE染色结果作为实验参照，判断B组的HE染色结果与A组的符合率。

2 结果

2.1 两组切片HE 染色情况两组切片均取材完整、厚度适宜、未见褶皱或刀痕、HE 染色核浆清晰、红蓝适度、透明洁净、封裱美观，具体可见图1，2。

2.2 两组切片HE 染色切片优良率比较A 组与B组优良率差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组切片HE染色切片优良率比较/例

2.3 B 组与A 组HE 染色结果符合率将A 组HE染色结果作为参照，B 组切片的优、良、中、差染色结果与A 组染色结果的符合率分别为97.4%（456/468）、98.2%（459/468）、99.4%（465/468）、100%（468/468），符合率最小为97.4%，将A 组HE 染色结果作为参照，B组HE染色结果预期符合率较高。

3 讨论

病理诊断是临床医学疾病诊断的金标准，而优质的HE切片一直是病理诊断的重要依据［6］。HE染色法可以将各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点清晰分明地显示出来，是组织学、胚胎学、病理学教学以及科研中最基本和使用最广泛的染色方法［7-8］。事实上，在近些年中，国内外学者一直尝试着使用各种环保试剂来替代甲醛和二甲苯在HE染色中的作用且成绩斐然［9］。

聚羟基丙烯酸是由多个羟基丙烯酸聚合而成，性质稳定的环保固定液，其固定组织的主要作用机制可能是羟基和羧基基团发生可逆的酯化反应，羧基和氨基集团中和反应，前者生成稳定的酯化物、硬化组织，后者维系稳定的反应条件，从而使聚羟基丙烯酸和蛋白质发生广泛的交联［10］。Van-clear是一种从桔皮或其他植物中提取的、不含芳香族化合物，性质稳定［11］。本研究采用环保试剂聚羟基丙烯酸和Van-clear 代替传统试剂甲醛和二甲苯来处理切片，研究结果显示，A、B两组的切片处理优良率相比差异无统计学意义（P＞0.05）；将A组HE染色结果作为参照，则B 组HE 染色结果预期符合率较高。研究结果说明环保试剂聚羟基丙烯酸和Van-clear处理切片与传统试剂甲醛和二甲苯处理切片HE 染色效果相当，该结果与陈志强等［12］研究结果一致。

4%的中性甲醛水溶液一直是病理学界的权威固定溶液，通过与蛋白质分子发生交联而产生作用，其渗透性强，固定均匀，对组织收缩的影响较小［13］。但有研究指出甲醛暴露可能导致蛋白质生理和病理功能的修改，干扰基因正常表达，且甲醛对环境具有污染性，可致癌和促癌［14］，在马德里召开的第二次国际会议也肯定了甲醛的毒性影响［15］。而环保试剂聚羟基丙烯酸同样可以和蛋白质发生广泛的交联，但其安全性高、无挥发性、固定的效率与甲醛相当，环保程度较甲醛高［16］。

100%的乙醇不能与石蜡相溶。进行HE 染色前需要脱去切片中的石蜡以利于染色剂更容易进入细胞和组织内，该过程称为脱蜡。透明脱蜡处理的作用机制主要是由于“相似相溶规律”，即溶质溶剂的结构相似而彼此相容［17］。常用的透明剂为二甲苯，二甲苯是由苯环组成的芳香烃化合物，而石蜡中80%～95%的成分为直链烷烃，相关资料指出［18-19］，Van-clear 主要由C8～C12 的饱和直链烷烃组合而成，与二甲苯的苯环结构相比更相似于石蜡［11］，因此可以推测Van-clear 与石蜡更加互溶，脱蜡效果更好，更利于HE染料着色。

综上所述，聚羟基丙烯酸和Van-clear 处理切片相较于甲醛和二甲苯更加环保、对病理工作人员的刺激性小、安全性高，在不改变任何处理程序的情况下效果相当，对于病理实验室而言具有运用、推广的意义。

（本文图1，2见封三）

图1 甲醛、二甲苯处理结果（HE×100）：1A为慢性宫颈炎组织；1B为宫颈腺癌组织；1C为脂肪组织；1D为骨髓组织图2 聚羟基丙烯酸、Van-clear处理结果（HE×100）：2A为慢性宫颈炎组织；2B为宫颈腺癌组织；2C为脂肪组织；2D为骨髓组织