一种识别Cu2+的罗丹明衍生物的合成及其性质研究

张 杰，戴红亮，郑琦君，覃于鑫，白翠冰，张 琳，李瑞乾，乔 瑞，苗 慧

（阜阳师范大学 化学与材料工程学院，安徽 阜阳 236037）

1 引言

1.1 Cu2+的生物作用

Cu2+对生命活动起着关键的作用[1-3]。Cu2+是生物体活细胞中常见的微量元素离子，参与各种生物酶的形成，例如过氧化物歧化酶、超氧化酶、单胺氧化酶等以及参加生物体内的氧化还原反应[4-6]。Cu2+在生物体内必须确保适宜的浓度，维持细胞正常的各种代谢，反之则会导致机体内会出现一系列问题。例如，细胞里Cu2+的浓度过高会导致细胞内器官损坏，从而导致发生神经性疾病。同时，癌症、心血管疾病、动脉硬化等疾病也与人体内Cu2+失衡有关[7-9]。因此，寻找一种高效，简单的方法去检测Cu2+是十分有意义的。

1.2 Cu2+的检测方法

传统方法经常是使用仪器手段实现了对Cu2+的检测（例如，高效液相色谱、电感耦合等离子体质谱、电化学）。但是这些分析方法存在一些不足，例如仪器昂贵、检测过程繁琐和样品需求量多等[10-12]。因此，找到一种快速，简便的检测环境中和生命体中的Cu2+是十分重要的。近些年以来，Cu2+荧光探针因其突出的优点而引起广泛关注[13-15]。合成得到灵敏度高和选择性好的荧光探针，一直是人们关注的热点之一。

1.3 本课题的设计思路

目前，香豆素类、萘酰亚胺类和氧杂蒽类等[16-18]多类化合物用来检测Cu2+。与其它荧光母体化合物相比，罗丹明类化合物具有独特OFFON 性质、稳定性好等诸多优点[19-22]。基于以上原因，设计合成得到了2-羟基-5-甲基苯甲醛修饰的罗丹明6G 衍生物LX，通过1H NMR 和13C NMR，确定了化合物LX 的结构。结合紫外光谱、荧光光谱和红外光谱，系统研究了化合物LX 与Cu2+之间的相互作用，推测了二者之间作用机理。化合物LX 还可以有效检测线虫体内的Cu2+。

2 实验设备和原料

2.1 实验设备

分析天平（上海赞维衡器有限公司，ZA100R3）；紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司，UV-9000S）；低温冷却循环泵（南京肯凡电子科技有限公司，KDC-0506）；旋转蒸发仪（上海恩生科技有限公司，ESRE-2010）；循环水式真空泵（郑州域达仪器有限公司，SHB-DIII）；磁力加热搅拌器（金坛市杰瑞尔电器有限公司，78-1）；电热鼓风干燥箱（河南信诺仪器设备有限公司，DHG-9053A）；比色皿（宜兴市伟鑫仪器有限公司，JB760-68）。荧光倒置显微镜（上海仪圆光学仪器有限公司，WMF-3690）。

2.2 原料和试剂

罗丹明6G（分析纯，阿达玛斯试剂有限公司），水合肼（分析纯，安耐吉公司），2-羟基-5-甲基苯甲醛（分析纯，安耐吉公司），无水乙醇（分析纯，安耐吉公司），金属离子均为分析纯的氯化盐，使用前未经二次处理。乙腈（色谱纯，阿拉丁公司）。实验过程中的水为去离子水。

3 实验部分

3.1 化合物A 的合成[23]

取罗丹明6G（1.5 g，3 mmol）在乙醇中与乙二胺回流。反应混合物在85℃下回流约8 h。反应完成后，将混合物冷却到室温，过滤产生的沉淀物，用20 mL 冰乙醇洗涤，用真空干燥得到化合物A(图1）。

图1 中间体A 的合成路线

3.2 荧光探针LX 的合成

用分析天平称取460 mg（1 mmol）的A 溶解于30 mL 的无水乙醇中，在85℃条件下进行加热回流。称取137 mg（1 mmol）2-羟基-5-甲基苯甲醛(B)，加入到反应溶液。随着反应的进行，有大量固体析出。反应结束后，趁热滤出固体，并用冰乙醇洗涤固体三次，得到荧光探针LX（图2）。产率为74.5%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 12.76 (s,1H),7.91 (s,1H),7.82 -7.73 (m,1H),7.54-7.42(m,2H),7.13-6.94(m,3H),6.72(d,J=8.3 Hz,1H),6.28 (s,2H),6.04 (s,2H),5.09 (t,J=5.4 Hz,2H),3.32 (d,J=6.5 Hz,2H),3.16 (dt,J=19.4,6.4 Hz,6H),2.21 (s,3H),1.80 (s,6H),1.22 (t,J=7.1 Hz,6H).13C NMR (101 MHz,DMSO-d6) δ 167.51,166.54,158.52,153.79,151.49,148.17,133.25,131.89,130.86,128.75,128.13,127.32,124.11,122.84,118.77,118.61,116.58,105.16,96.03,64.55,56.82,37.93,20.38,17.48,14.62.（附录1，附录2）。

图2 荧光探针LX 的合成路线

3.3 金属离子的识别

用乙腈配制浓度为1.0×10-4mol/L 荧光探针LX 和不同的金属离子（NaCl、CuCl2·2H2O、YCl3·7H2O、CoCl2、MgCl2、CeCl3、CdCl2、AgCl、KCl、Ni-Cl2、ZnCl2、HgCl2、FeCl3·6H2O、BaCl2、PbCl2、SrCl2、MnCl2、CaCl2、AlCl3、FeCl2·4H2O）的溶液。分别取荧光探针LX 溶液300 μL 和不同金属离子溶液900 μL，然后定容到3000 μL，单独荧光探针LX稀释到相同浓度(1.0×10-5mol/L）作为对照组依次检测21 组待测溶液的紫外和荧光光谱强度的变化。

3.4 抗干扰实验

其他干扰金属离子(NaCl、YCl3·7H2O、CoCl2、MgCl2、CeCl3、CdCl2、AgCl、KCl、NiCl2、ZnCl2、Hg-Cl2、FeCl3·6H2O、BaCl2、PbCl2、SrCl2、MnCl2、CaCl2、AlCl3、FeCl2·4H2O)被加入到荧光探针LX 对Cu2+的体系中。取荧光探针LX（1.0×10-4mol/L）乙腈溶液300 μL，加入Cu2+（1.0×10-4mol/L）的乙腈溶液900 μL，然后，干扰离子溶液（1.0×10-4mol/L）900 μL 被加入到混合溶液，最后溶液用乙腈稀释定容到3000 μL。

3.5 连续变化法

所测混合溶液的总体积（3000 μL）保持不变，溶液中[Cu2+]/([Cu2+]+[LX])的比例从0.1,0.15,0.2依次递增至0.95。Cu2+的溶液（1.0×10-4mol/L）的体积依次从100 μL，150 μL，200 μL 递增至950 μL，保持时间间隔相同，并测试紫外和荧光强度的变化。

3.6 摩尔法

固定体积为300 μL 荧光探针LX 的乙腈溶液（1.0×10-4mol/L），不同体积的Cu2+乙腈溶液（1.0×10-4mol/L）被依次加入，改变[Cu2+]/[LX]比例从0.0，0.1，0.2，0.3 依次间隔0.1 递增到2.0。溶液被乙腈稀释定容到3000 μL，测定紫外和荧光光谱。

3.7 红外光谱(LX，LX-Cu2+)

称取15 mg 荧光探针LX 和25 mg 的CuCl2·2H2O 溶于20 mL 乙腈溶液，在室温搅拌0.5 小时，溶液在结晶皿中挥发，得固体。测试化合物LX 和LX-Cu2+红外谱图。

3.8 检测水中的Cu2+

通过自制的试纸条，先浸泡在荧光探针LX（1.0×10-4mol/L）溶液中，然后自然晾干备用。把准备好的试纸条依次浸泡在含有Hg2+，Fe3+，Cu2+，Al3+，Fe2+的水溶液中大概1 分钟，然后把试纸条拿出来晾干通过裸眼和紫外灯观察他们的颜色变化。

3.9 在生物体内检测Cu2+

在20℃下，秀丽隐杆线虫与琼脂一起培养。三天后，把秀丽隐杆线虫取出放入96 孔板然后加入LX（0.1 mL，1.0×10-4mol/L，DMSO/H2O=2：8）接着与琼脂脂一起孵育30 分钟，然后，一些线虫加入Cu2+（0.1 mL、2.0×10-4mol/L、H2O）的水溶液，继续培养1 小时。最后线虫用M9（NGM 培养基）洗涤琼脂和残留的物质，然后在荧光倒置显微镜观察荧光成像。

4 结果与讨论

4.1 离子的可视化检测

通过观察溶液中的颜色变化情况，考察荧光探针LX(1.0×10-5mol/L)对各种金属离子的选择性识别能力。从图3 可以看出，当上述金属离子加入LX 溶液中时，只有Cu2+能引起溶液颜色变化。在可见光下显示颜色从无色变为粉红色（图3a），并且在紫外灯下观察到荧光显著增强（图3b），而其它离子则不能引起类似变化。

图3 金属离子响应照片（a：日光下照片，b：365 紫外灯下照片）

4.2 金属离子选择研究

通过光谱可以看出（图4），当Cu2+加入荧光探针LX 的溶液中，探针LX 在525 nm 出现了一个新的吸收峰。利用525 nm 激发溶液，可以观察到在550 nm 处荧光明显增强。而Fe3+、Fe2+、Hg2+、Na+、Y3+、Co2+、Mg2+、Ce3+、Cd2+、Ag+、K+、Ni2+、Zn2+、Ba2+、Pb2+、Sr2+、Mn2+、Ca2+、Al3+则对荧光探针LX 选择性识别Cu2+没有明显影响，这可能是Cu2+的加入使得罗丹明开环。此外，通过其他离子共存实验，进一步得出荧光探针LX 可以专一识别Cu2+并且其它离子并不构成干扰（图5）。

4.3 荧光探针LX 与Cu2+化学计量比

使用摩尔比法和连续变化法确定荧光探针LX 对Cu2+之间的化学计量比。结果发现随着Cu2+浓度的增大荧光探针LX 的吸光度和荧光强度不断的增高，当（[Cu2+]/[LX]）=1.0 时，Cu2+的浓度增大的同时吸光度和荧光强度无明显变化（图6）。结果表明，荧光探针LX 与Cu2+之间的相互作用比为1:1。固定（[LX]+[Cu2+]）浓度不变（3.3×10-5mol/L），改变（[Cu2+]/([LX]+[Cu2+]）比例从0.05增加到0.95，我们发现两条交于一点的不同斜率的直线，刚好对应Cu2+的摩尔分数（0.5）的横坐标。连续变化法的结果与摩尔比法相符合，进一步验证了该结论。上述结果表明，荧光探针LX与Cu2+是1:1 作用的（图7）。

图6 摩尔比法确定荧光探针LX 与Cu2+之间的化学计量比

图7 连续变化法确定荧光探针LX 与Cu2+之间的化学计量比

4.4 荧光探针LX 与LX-Cu2+红外光谱及机理预测

当荧光探针LX 与Cu2+溶液相互作用后，红外光谱发生了改变（图8）。当Cu2+与-OH 发生了配位后，属于-OH 的3460 cm-1处的峰消失，同时当Cu2+加入时探针LX 发生了N-H 健到C=N 健的互变异构出现了一个新的吸收峰1657 cm-1。结合上述荧光探针LX 与Cu2+的化学作用比为1:1的结论，所以我们推测荧光探针LX 与Cu2+的可能的作用方式如图9。

图8 荧光探针LX 和LX-Cu2+的红外光谱图

图9 荧光探针LX 与Cu2+可能的络合机理

4.5 在水中检测Cu2+

为了进一步探索荧光探针LX 的实际应用，我们自制了试纸条来进一步检测水中的Cu2+。根据图10，我们发现LX（1×10-4mol/L）试纸条是无色，但使用Cu2+水溶液浸泡后，肉眼显示为红色，紫外灯下观察到明显荧光增强现象。结果表明，荧光探针LX 可以很好的检测水中的Cu2+，这样使得在金属离子污染检测有很好的应用前景。

图10 试纸条检测水中的Cu2+（从左到右为Hg2+，Fe3+，Cu2+，Al3+，Fe2+，离子溶液为水溶液）

4.6 生物成像

为了进一步探索荧光探针LX 在生物体中的实际应用，我们选取了线虫作为实验的研究对象。从图11 可以看来，线虫自身没有荧光，当和荧光探针LX 培养后依然没有荧光。但是当线虫和荧光探针LX 培养后接着和Cu2+培养，我们发现很明显的绿色和红色的荧光。通过线虫实验，我们进一步得出该荧光探针LX 在生物体中检测Cu2+具有潜在的能力。

图11 线虫的荧光显微镜成像（a）单独线虫的荧光成像图，（b）线虫被LX（1.0×10-4 mol/L,DMSO/H2O=2:8）处理后的荧光图像，（c）用Cu2+（2.0×10-4 mol/L,H2O）处理的负载荧光探针LX 的线虫的荧光图像。从左到右是明场，绿色通道，红色通道

5 结论

本文设计合成得到了一种罗丹明衍生物LX。该化合物能够快速高效并且专一识别Cu2+，与Cu2+之间的络合比为1:1，对Cu2+检出限为1.06×10-8M，可以实现对水中的Cu2+的有效检测。利用荧光成像方法，实现了线虫体内Cu2+的检测。