环境与食品样品中硒的化学连续提取法的应用研究进展

张 菁，丁 颀，覃松生，谢春生

（1.肇庆学院 环境与化学工程学院，广东 肇庆 526061；2.怀集县农业技术推广中心，广东 肇庆 526061）

硒（Se）是人体必需的微量元素之一，具有“天然解毒剂”的称号，在生物体的能量代谢中起着重要的作用.研究表明，硒具有抗病毒、抗氧化等作用，对生物的免疫调节功能有重要作用[1-2].我国72%地区存在低硒或缺硒情况，其中30%为严重缺硒地区[3].人们通常通过对农产品施加硒肥，从而增加产品的硒含量[4-5].硒在人体中多以硒代蛋氨酸等有机形态被人体胃肠道吸收[6]，由于有机硒具有亲和性强、人体吸收率高等优点，因此提高有机硒含量或者增大有机硒转化率直接关系到富硒食品的质量.由此可见，不能仅测定和提取硒的无机形态和有机形态，更要具体测定硒的各形态的含量，以及有效提取出硒的各种形态，才能更准确判断环境和食品样品中硒的有效成分的含量.本文主要研究分析环境与食品样品中硒的传统分离测试技术，元素的化学顺序提取技术和硒的化学连续提取技术的国内外研究进展.

1 传统硒测定与分离技术

在环境和食品样品中，硒的分离测定主要以总硒、有机硒与无机硒为主.在环境（以土壤为主）中，硒的形态主要分为有效态、潜在态和无效态[7]，有效硒则以土壤-植物体系进入人体内，其吸收方式会根据不同形态的硒源改变，例如有机硒遵循氨基酸吸收机制等与血红蛋白结合，形成硒蛋白，运送至不同器官[8].

1.1 原子荧光光谱分析法（AFS）

AFS法根据原子吸收特征波长的辐射后，发射出特征波长荧光，从而判断原子及其同位素的含量.其优点为精密度高、检出限较低等，但是也由于其需要手动稀释部分样品，导致分析时间较长[9].AFS法具有样品普适性强，无需有机硒标准品等优点.在该体系的最优条件下，测定方法回收率为86.68%～113.48%，检出限为0.02 ng/ml.姜能座[10]建立了一种通过将富硒产品进行粉碎、均质等操作，将其中的有机硒和无机硒测定与分离出来的方法.Licheng Chen等人[11]采用HG-AFS方法测定以及比较分析了普通精米和富硒精米中硒的含量，该研究回收率为101.05%，表明HG-AFS方法可以可靠地用于大米中硒的测定，同时可以通过生物富集硒的方法来提高大米中硒的含量.不仅在食品样品中，AFS法也可以用于环境样品检测.李美秀等人[12]采用酸消耗较少的微波消解法消解土壤，且与双通道原子荧光光谱法联用，对实验条件进行了优化，测定了土壤中总硒含量.此外，陈娥等人[13]采用原子荧光形态分析法和AFS法，检测出土壤中有效硒的含量，为制定土壤有效硒测定方法标准奠定了基础，结果表明植物硒含量与土壤有效硒含量密切相关[14]，为测定和分离有效硒提供了理论基础.

1.2 电感耦合等离子体-质谱法（ICP-MS）

ICP-MS 法是常用于检测硒含量的无机质谱技术，因具有分析校准曲线线性范围较宽、分析速度快等优点被广泛应用于环境和食品样品中硒的测定，但也会受多原子离子的干扰使得硒的微量测定结果误差较大[15].由于硒具有多种同位素，可以根据不同价态硒的灵敏度所显示的吸收峰进行分析.

在土壤和食品中，ICP-MS可以测定总硒、有机硒与无机硒的含量.秦冲等人利用不同提取剂，测定并分析土壤中的亚硒酸盐和硒酸盐[16]；Man He等人[17]还将ICP-MS与磁性固相萃取相结合的方法，同时测定了环境水体中硒的形态；姜伟等人[18]选用对出峰形较好的流动相为pH5的柠檬酸铵溶液检测出大米中的有机硒含量；艾春月[19]则使用BCA法和Bradford法2种方法，测定了茶叶中含硒的蛋白质.但是仅仅测定硒的含量还不能满足人们对硒的认识，由此彭立核等人[20]将ICP-MS法与HPLC法结合起来，利用不同的流动相与洗脱方式，将SeCys、MeSeCys、Se（VI）、SeMet与Se（IV）分离出来；邵鹏威等人[21]采用Hamilton PRP-X100分析柱和pH4和pH6的柠檬酸溶液为流动相，9 min内将SeCys、MeSeCys、Se（VI）、SeMet与Se（IV）逐步分离出来.

2 元素的化学顺序提取技术

化学顺序提取技术的原理是采用不同的化学溶剂浸出等一系列操作条件，根据特定元素的不同形态有不同化学反应的现象进行分离提取.但在浸取过程中，不能避免每一级浸取程序之间不同元素的不同形态的干扰[22].

2.1 Tessier法

Tessier 法详细划分了金属的5 种结合形态：可交换态、碳酸盐态、铁（锰）氧化物结合态、有机态和残渣态，但仍存在许多难以克服的缺点：分析结果的可比性差，缺乏统一的标准分析方法等[23].邓晓霞等人[24]采用了Tessier 5步提取法与改进的BCR法比较分析了重金属形态以及提取能力，Tessier提取法提取出的Pb、Cd的交换态等结合态的生物有效性高.Janas M等人[25]则利用Tessier法测定了污水污泥中选定金属的固定化程度，确定其总含量且评估其浸出率.

2.2 BCR法

BCR法是欧洲参考交流局在Tessier分析方法基础上，提出较新的金属划分方法，分别是弱酸提取态、可还原态、可氧化态和残渣态.但由于金属的形态可能会随着浸取程序而发生动态变化，因此人们更多使用改进后的BCR提取法.Pérez Cid B等人[26]采用传统的三级BCR顺序萃取法对城市污泥样品进行了重金属分离，其金属回收率在90.09%至103.7%之间；Jamali M K 等人开发并优化了一种快速微波辅助与改进后的BCR法相结合，测定和提取污泥中的Cd、Cr、Cu、Ni、Pb和Zn[27]；而罗乐等人更是将ICP-MS法与BCR法结合起来，优化后的BCR法模拟了自然环境条件，连续提取不同土壤中的Cd、Zn等元素的交换态、还原态和氧化态，对研究土壤重金属的来源和治理与修复有一定意义[28].

2.3 SMT法

SMT 法是由欧洲标准测试测量组织为改变磷形态测试中方法多种多样，且不统一的情况所建立的[29].SMT 法因其操作简单、重复性好等优点，被广泛应用于沉积物磷形态的分析.俞振飞等人在原有的有机磷（OP）提取步骤基础上进行了改进，其结果也表明改进后的OP提取法具有可行性[30]；杨柳等人[31]则采用SMT法对沉积物中的总有效磷/浓缩的HCl磷、无机磷等5种磷的形态进行测定并分析，表明无机磷是沉积物中磷的主要赋存形态；对于湖泊中的沉积物，刘冠男等人[32]探讨和比较了SMT 法、Ivanoff 法、Golterman 法对有机磷形态的分析结果，证明了提取剂和提取顺序的不同对不同磷形态提取结果存在差异，该研究结果对于沉积物磷形态的顺序提取方法的选择具有指导意义.

3 硒的化学顺序提取方法

3.1 无机硒的顺序提取

在硒的各种形态中，人类对无机硒的吸收和利用效率较低，无机硒过量会对人体造成一定副作用.通常认为，无机硒主要形态为可溶于水的硒酸盐Se（IV）和亚硒酸盐Se（VI）[33].在土壤-植物-动物体系中，植物可以吸收的部分则称为土壤中有效态硒，而具体硒的分级形态以及提取剂见表1.朱英等人[34]的3步提取法研究表明，去离子水能有效提取水溶态硒，在残渣中加入KH2PO4溶液得到交换态硒，而在提取交换态后的残渣加入Na2P2O7溶液便得到富啡酸态.硒的4步分级提取则是以GB/T 25282-2010为常用方法；而且Michael T等[35]对比了2种连续提取程序提取湿地沉积物中4种稳定存在的硒形态（可溶性硒、硒酸盐、元素硒和金属硒化物）.唐沫岚等人[36]在富硒土壤中，用0.1 mol/LpH7的缓冲溶液提取出可交换态硒，有机结合态硒则用0.1 mol/LNaOH溶液提取等溶剂分离了硒的5种形态.而张忠等人[37]研究开发了一种硒的循序偏提取，将硒分为6种形态如水溶态、可交换态等，建立了硒的6步顺序提取法.李璐等人[38]则将土壤中硒的存在形态更加细分为7种形态（元素态硒、Fe-Mn氧化物和碳酸盐结合态硒、硫化物/硒化物硒等），推进了硒的有效性测定和提取工作，为人们更好地分析和利用硒提供了基础.除了硒的分级提取外，探究硒分级提取的影响因素对硒的化学顺序提取仍具有重要意义.Yu Liu等人[39]根据吸附机理制备了LDHs功能化Cas，并将其应用于硒溶液的分离，而且研究吸附时间等不同因素对分离硒溶液的影响.

表1 硒的分级形态以及提取剂

3.2 有机硒的顺序提取

在农产品或者食品中，硒蛋白、SeMet、SeCys等为代表的有机硒对生命体新陈代谢的作用更为直接且更易被人体所吸收，因此对有机硒形态分析和提取尤为重要. 目前，有机硒提取分析法按照提取剂不同分为水提取法、酸提取法、辅助酶解法和循环提取法等[41].曾云想等人[42]建立了以高效液相色谱-原子荧光光谱检测大米中6种形态，同时使用超声辅助酶提取样品中的Se（IV）、Se（VI）、SeMet、SeCys、MeSeCys和SeEt.Mei Sun等人[43]采用室温超声-水-环已烷顺序萃取法对富硒大米中的有机硒和无机硒有效地分离.张雪玲等人[44]采用相似相溶原理，选用了乙醇、乙酸乙酯、环已烷对茶叶中有机硒进行提取，同时证明采用乙醇回流提取法效果更好，该方法操作简单、灵敏，为茶叶中有机硒的提取方法研究提供了依据.李华为等[45]研究表明以浓度0.15 mol/L氢氧化钠溶液作为提取剂，在料液比1:30条件下，可溶性硒蛋白提取效率较高[45]；而杨丹等人[46]将磷酸盐缓冲液与考马斯亮蓝G-250试剂结合起来，测定与提取硒蛋白含量.不仅使用碱溶液提取有机硒，人们还利用酸溶液提取有机硒，如梁潘霞等人[47]研究采用pH6.0的磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液重复提取，合并3次所得的提取液即是弱酸溶性硒蛋白溶液，但酸会使硒形态发生转变，导致其蛋白活性丧失.

4 结论

环境与食品样品中硒的化学连续提取法研究，有助于进一步深入了解硒的赋存形态，有助于进一步促进富硒食品与富硒农产品的开发和推广.然而目前国内外对环境与食品中硒的化学连续提取法提取系统不统一，导致不同提取方法之间难以比对衡量；同时存在对有机硒的提取方式过于简单，往往不能有效提取样品中硒蛋白等问题.