阴道微环境及白介素-4与宫颈高危型人乳头状瘤病毒感染的相关研究

周源源，杜凌颖，齐梦娟，郭 颖

（大理大学第一附属医院，云南大理 671000）

人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是诱发宫颈癌的主要病因。到目前为止，已鉴定出200多种HPV基因型，它们中的一些会感染生殖道，并具有较高的致癌潜力，称为高危型HPV（high-risk human papilloma virus，HR-HPV），其中与宫颈癌相关性最高的为16型和18型〔1〕。阴道微环境对女性感染性传播疾病过程有一定的影响，在宫颈病变过程中也发挥着重要的作用〔2〕，依赖于机体和微生物调节的动态平衡系统，与阴道菌群本身、微生物代谢产物及一系列反应形成的局部免疫环境密切相关。评价体系分为形态学和功能性2个方面，形态学评价包括阴道菌群的密集度、多样性以及优势菌、病原微生物等；功能性评价主要包括阴道pH值、H2O2浓度以及其他微生物代谢产物和酶类，其中任何一项指标异常都可以判为阴道微生态失调〔3〕。阴道菌群结构一旦遭到破坏，阴道内的某些病原微生物就会大量繁殖，从而导致阴道微环境的改变。白介素-4（interleukin-4，IL-4）是一种多效性细胞因子，是调节机体Ⅱ型体液免疫反应的特征性因子。IL-4不仅可以促进Th2细胞分化、抑制Th1细胞增殖，还可以调节不同类型细胞的增殖、分化和凋亡〔4〕。IL-4在宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）1级（CINⅠ）和2级（CINⅡ）患者外周血中较健康对照人群明显升高，引起全身免疫反应。由此提示，在宫颈感染HRHPV后，IL-4可能参与宫颈从防御病毒入侵到发病的整个过程。故本研究探讨阴道微环境及阴道灌洗液中IL-4水平与宫颈HR-HPV感染的相关性，为宫颈癌的防治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 资料来源 选取2018年12月至2019年12月在大理大学第一附属医院就诊的宫颈HR-HPV感染的育龄期患者为观察组（A组），共85例；根据分型检测结果将HPV16型和/或18型患者归入A1组（共40例，其中混合感染8例），非HPV16型或非HPV18型患者归入A2组（45例）。选取同期在大理大学第一附属医院体检的宫颈HPV检测阴性者为对照组（B组），共83例。纳入标准：①宫颈HPV检测结果为HR-HPV阳性者；②有性生活史者；③既往HPV检测阳性未治疗要求复查者；④因外阴瘙痒等症状就诊者；⑤要求孕前检查或常规体检者；⑥自愿接受阴道分泌物及HPV检测者。

1.2 方法

1.2.1 阴道菌群的识别及计数 ①以湿片法查看滴虫、假丝酵母菌和芽生孢子，同时判定阴道清洁度；②将干棉签上取得的阴道分泌物涂片，干燥，固定后进行革兰氏染色；③在10×100倍油镜下识别乳酸杆菌并计数分级；④在10×100倍油镜下对乳酸杆菌、加德纳菌、普雷沃菌和动弯杆菌半定量评估，并进行Nugent评分。

1.2.2 阴道pH值检测 用干燥精密pH试纸（3.8～5.4）放置于阴道上1/3侧壁，1 s后取出，与标准比色卡比对，得到阴道pH值。

1.2.3 阴道分泌物检测 用阴道炎联合检测试剂盒检测阴道分泌物中是否含有H2O2和白细胞酯酶。H2O2反应孔不显色或淡黄色或浅红色计为阳性，红色或紫红色计为阴性；白细胞酯酶反应孔蓝色计为阳性，淡浅色或不显色计为阴性。

1.2.4 IL-4检测 取4 mL无血液的阴道灌洗液，用人IL-4酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒检测每份灌洗液样本的吸光度（OD）值，以标准品48、24、12、6、3、0 pg/mL对应的OD值绘制标准曲线，根据样本OD值计算每份样本IL-4含量。

1.2.5 宫颈HPV分型检测 采用人HPV分型检测试剂盒，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）-反向点杂交法进行检测，包括23种HPV分型，其中，17种HR-HPV分型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82型）和6种低危型HPV分型（6、11、42、43、81和83型）。1.2.6 统计分析 应用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，计数资料组间比较使用χ2检验，计量资料比较运用单因素方差分析，多变量分析使用Logistic回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HR-HPV感染与年龄分布的关系168例纳入研究的女性中，A组85例，B组83例，比较两组女性的年龄，差异无统计学意义（P＞0.05）。26～45岁女性HR-HPV感染率显著低于年龄≤25岁和年龄＞45岁的女性，不同年龄段女性HR-HPV阳性率比较差异有统计学意义（χ2=16.910，P=0.001＜0.05）。见表1。

表1 HR-HPV感染与年龄分布的关系

2.2 HR-HPV感染与阴道微环境评价指标的关系

2.2.1 阴道清洁度 根据白细胞酯酶活性判断阴道清洁度。阴道清洁度Ⅰ～Ⅱ级为正常，计为阴性；阴道清洁度Ⅲ～Ⅳ级为异常，计为阳性。A1组、A2组与B组3组之间阴道清洁度阳性率比较差异均有统计学意义（χ2=17.112，P＜0.05），其中，A1组和A2组的阳性率均高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A1组阳性率高于A2组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2.2 乳酸杆菌 乳酸杆菌＋＋～＋＋＋提示阴道微生态正常，计为阳性；乳酸杆菌＋或＋＋＋＋判定为阴道微生态失调，计为阴性。A1组、A2组与B组3组之间乳酸杆菌阳性率比较差异均有统计学意义（χ2=21.414，P＜0.05），其中，阳性率B组最高，A1组最低。见表2。

2.2.3 pH值 阴道pH值≤4.5为正常，pH值＞4.5为异常。A1组、A2组与B组3组之间pH值异常率比较差异均有统计学意义（χ2=22.568，P＜0.05），其中，异常率A1组最高，B组最低。见表2。

2.2.4 H2O2根据阴道炎联合检测试剂盒检测结果显示，A1组、A2组与B组3组之间H2O2阳性率比较差异均有统计学意义（χ2=15.635，P＜0.05），其中，A1组和A2组的阳性率均低于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A1组阳性率低于A2组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 HR-HPV感染与阴道微环境评价指标的关系［n（%）］

2.3 HR-HPV感染与常见阴道炎的关系

2.3.1 滴虫性阴道炎（trichomonas vaginitis，TV）168例纳入研究的女性中，TV阳性41例（占24.4%），其中，A1组18例（45.0%），A2组15例（33.3%），B组8例（9.6%）。A1组、A2组与B组3组之间TV阳性率比较差异均有统计学意义（χ2=30.670，P＜0.05）。

2.3.2 细菌性阴道 病（bacterial vaginosis，BV）168例纳入研究的女性中，BV阳性35例（占20.8%），A1组17例（42.5%），A2组13例（28.9%），B组5例（6.0%）。A1组、A2组与B组3组之间BV阳性率比较差异均有统计学意义（χ2=26.684，P＜0.05），其中，A1组和A2组的阳性率均高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A1组阳性率高于A2组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 HR-HPV感染与阴道灌洗液中IL-4水平的关系比较3组阴道灌洗液中IL-4的水平，结果显示，A1组含量最高，为（26.28±0.912）pg/mL，A2组含量次之，为（23.44±1.129）pg/mL，B组含量最低，为（7.61±0.479）pg/mL，差异有统计学意义（F=9 583.95，P＜0.05）。

2.5 多变量Logistic回归分析以是否存在HRHPV感染为因变量，以乳酸杆菌、白细胞酯酶、TV、BV为自变量构建Logistic回归分析模型。以输入法引入Logistic回归方程进行多因素非条件Logistic回归分析。结果显示，乳酸杆菌、TV、BV、白细胞酯酶均是HR-HPV感染的独立危险因素。见表3。

表3 HR-HPV感染的Logistic回归分析

3 讨论

宫颈癌是世界第四大常见肿瘤，每年影响着约53万女性的健康〔5〕。近年来，我国宫颈癌发病率逐年增加，宫颈HR-HPV感染被认为是宫颈癌发病的必然原因〔1〕。阴道微环境是一个复杂的生态系统，它的平衡与阴道菌群、阴道局部免疫功能等密切相关。

本研究结果显示，HR-HPV感染有2个年龄高峰，分别是年龄≤25岁（占85.0%）和年龄＞45岁（占81.8%），这与De Sanjos等〔6〕对欧美女性的研究结果基本一致。由此说明，年龄≤25岁及年龄＞45岁的女性更易感染HR-HPV。

本次研究结果显示，A1组、A2组与B组之间阴道清洁度阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05），说明感染HR-HPV与阴道清洁度异常有相关性，与张旭梅等〔7〕研究结果一致。乳酸杆菌在维护阴道微环境的动态平衡上发挥着重要的作用，乳酸杆菌主要代谢产物是乳酸和H2O2，乳酸可以维持阴道正常pH。本研究显示，A组与B组间的乳酸杆菌、pH值和H2O2比较差异有统计学意义（P＜0.05），阴道乳酸杆菌阴性是HR-HPV感染的独立危险因素。乳酸杆菌、pH值在A1组与A2组之间差异有统计学意义（P＜0.05），与乔峤〔8〕及Clarke等〔9〕研究结果一致。说明乳酸杆菌的减少、pH值异常与HR-HPV的感染密切相关，尤其与HPV16型和/或18型感染显著相关。

TV是性传播疾病，需夫妻同治，否则易复发。阴道毛滴虫定植后，使阴道微生态失调、阴道黏膜及局部免疫遭到破坏，加速HPV的侵入。Lazenby等〔10〕研究显示TV与HR-HPV感染（特别是16型）显著相关。本次研究结果显示，TV阳性率在A组与B组间差异有统计学意义（P＜0.05），TV阳性是HRHPV感染的独立危险因素。TV阳性率在A1组与A2组间差异有统计学意义（P＜0.05）。BV是育龄期女性最常见的阴道炎之一，从微生物学角度看，BV的特点是阴道微生物区系改变，从以乳酸杆菌为主转变为由兼性厌氧和严格厌氧细菌组成的多微生物区系〔11〕。Haddad等〔12〕研究表明，BV在HPV、沙眼衣原体、淋球菌等病原体的传播中起着促进作用。本研究结果显示，BV阳性率在A组与B组间差异有统计学意义（P＜0.05），BV阳性是HR-HPV感染的独立危险因素。BV阳性率在A1组与A2组间差异无统计学意义（P＞0.05），与Haddad等〔12〕研究结果基本一致，说明感染BV的女性更易感染HR-HPV。

IL-4是调节机体Ⅱ型体液免疫反应的特征性细胞因子，主要由Th2细胞分泌，同时，其又可以促进Th2细胞分化。研究发现IL-4过度产生会导致如过敏性哮喘、特应性皮炎、嗜酸性食管炎等过敏性疾病的发生〔13〕。正常情况下，Th1/Th2居于动态平衡状态维持机体正常免疫功能，当HPV侵入机体后，机体的免疫平衡被打破，Th2细胞及细胞因子增多。Sasagawa等〔14〕和Peghini等〔15〕的研究证实HPV感染后患者外周血的白介素-2（interleukin-2，IL-2）水平降低，白介素-10（interleukin-10，IL-10）水平明显升高，说明HPV感染可能导致Th1/Th2失衡，Th2细胞分泌的IL-10浓度也因此升高。Sharma等〔16〕研究发现CINⅠ、CINⅡ患者外周血中IL-4水平较健康对照组明显升高。本研究中，A组阴道灌洗液中IL-4水平高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05），与Sharma等〔16〕研究结果一致。此外，IL-4水平在A1组与A2组之间差异有统计学意义（P＜0.05），由此说明，阴道灌洗液中IL-4的高水平状态与HR-HPV感染有关，特别是HPV16型和/或18型的IL-4水平较其他HR-HPV分型更高。