肺炎支原体肺炎病儿血清长链非编码RNA MALAT1、微小RNA-125b的表达及临床意义

王秋菊

作者单位：许昌市人民医院NICU，河南 许昌461000

肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneu‑monia，MPP）是小儿常见的呼吸道感染，支原体感染不仅引起呼吸道的炎性改变，也可引起全身炎性反应综合征，甚至导致多器官功能的损害［1-2］。在MPP的进展过程中，炎症反应及其相关的器官功能损害具有重要的作用。长链非编码RNA MALAT1（Long non-coding RNA MALAT1，LncRNA MALAT1）可通过调控细胞增殖、凋亡等生物学过程从而参与多种疾病发生及发展过程。研究表明，MALAT1 在特异性感染过程中，参与炎症反应的过程，与病情的进展有关［3-4］。并且能够通过调控微小RNA-125b（mi‑croRNA-125b，miR-125b）的表达从而参与炎症进展及器官功能损害的过程［5］。本研究就不同病情及病程MPP 病儿血清LncRNA MALAT1、miR-125b 表达情况进行研究，为MPP 病情及预后的评估提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2016 年4 月至2018 年6 月许昌市人民医院收治的MPP病儿40例（MPP组），其中男23 例，女17 例，年龄（4.56±2.13）岁，范围为1～8岁。纳入标准：（1）MPP 急性期符合《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识（2015 年版）》［6］中诊断标准；（2）病儿近亲属自愿纳入研究。排除标准：（1）合并其他部位感染；（2）合并免疫系统疾病；（3）合并心血管系统畸形或肺结核等其他病原菌感染。病儿病情轻型26 例，重型［7-8］14 例。选择同期该院体检的健康儿童40 例作为对照组，男22 例，女18 例，年龄（5.19±3.22）岁，范围为1～10 岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1标本采集 对照组入组后采集空腹静脉血3 mL，MPP组病人入组后及治疗进入缓解期后分别采集空腹静脉血3 mL，血液样本置于离心管内，4 ℃条件下经3 000 r/min离心5 min，分离血清，置于−80 ℃超低温冰箱保存，分批检测。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测LncRNA MALAT1、miR-125b 的表达水平 对照组入组后、病儿入组后及病情进入缓解期后采用Trizol 试剂提取血清中总RNA，应用Nano‑drop2000c 超微量分光光度计测定RNA 浓度，根据逆转录试剂盒说明书操作将总RNA 逆转录合成互补DNA（cDNA）。MALAT1 正向引物5’-CTTAAGC‑GCAGCGCCATTTT-3’，反向引物 5’-CCTC‑CAAACCCCAAGACCAA-3’；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）正向引物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGA‑AC-3’，反向引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-125b 正向引物5’-ATCACAGGTCAG‑GCTCTTGG-3’，反向引物5’-ACGTCAGATAGC‑TAGCTCTACG-3’；U6 正向引物5’-ATTGGAAC‑GATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAAC‑GCTTCACGAATTTG-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR 反应体系：SYBR Green Master Mix 10 µL，正反向引物0.8 µL，cDNA 1 µL，ddH2O 补足体系至20 µL；反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环40 次。置于ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪检测，LncRNA MALAT1 以GAPDH 为内参，miR-125b 以U6 为内参，采用2−ΔΔCt法LncRNA MALAT1、miR-125b 相对表达量。Trizol 试剂、逆转录试剂盒与荧光定量PCR 试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 检测血清CRP、IL-6 及TNF-α 检测 病儿及对照组入组后应用P800型全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）检测血清C 反应蛋白（CRP）水平，检测方法为比浊法，由该院检验科完成检测；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，检测试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司，检测过程严格按照试剂及仪器使用说明书进行。

1.3 统计学方法采用统计学软件SPSS 21.0 进行分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验；采用Pearson相关性分析检验变量之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组儿童血清MALAT1、miR-125b 的表达量比较与对照组相比，MPP 组血清MALAT1 的表达水平升高［（2.13±0.16）比（1.00±0.10），t=37.89，P<0.001］，miR-125b 的表达水平降低［（0.52±0.11）比（1.01±0.13），t=18.20，P<0.001］。

2.2 不同病情MPP 病儿血清MALAT1、miR-125b的表达量比较轻症型MPP 病人血清MALAT1 表达量低于重症型［（1.62±0.23）比（2.97±0.31），t=15.65，P<0.001］，miR-125b 表达量高于重症型［（0.77±0.13）比（0.32±0.07），t=12.00，P<0.001］。

2.3 两组儿童血清CRP、IL-6、TNF-α 水平比较与对照组相比，MPP 组病儿血清CRP、IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05），见表1。

表1 两组儿童血清CRP、IL-6、TNF-α水平比较/± s

注：CRP 为C 反应蛋白，IL-6 为白细胞介素-6，TNF-α 为肿瘤坏死因子α，MPP为肺炎支原体肺炎。

例数40 40 IL-6/（ng/L）13.21±3.98 35.26±8.52 14.83<0.001组别对照组MPP组t值P值CRP/（mg/L）3.22±1.16 11.16±3.13 15.04<0.001 TNF-α/（ng/L）14.32±4.21 32.31±8.57 11.92<0.001

2.4 MPP 病儿血清LncRNA MALAT1、miR-125b的表达量与CRP、IL-6、TNF-α的相关性Pearson相关性分析结果显示LncRNA MALAT1 表达量与CRP、IL-6、TNF-α 呈正相关，miR-125b 的表达量与CRP、IL-6、TNF-α呈负相关（P<0.05），见表2。

表2 MPP病儿40例血清LncRNA MALAT1、miR-125b的表达量与CRP、IL-6、TNF-α的Pearson相关性分析结果

3 讨论

LncRNA MALAT1 是定位于细胞核核小体核斑区的长链非编码RNA，是一个高度保守序列，虽然不具有蛋白编码功能，但能够通多多种形式实现对功能蛋白转录和转录后功能进行调控。LncRNA MALAT1 对细胞的增殖及迁徙能力具有促进作用，在肿瘤的进展及转移中具有重要作用。miR-125b是内源性的非编码微小RNA，能够通过与mRNA 的结合抑制或诱导蛋白的翻译，进而发挥生物活性作用。近年来的研究发现，miRNA 生物活性作用的发挥不仅包括对mRNA 活性的调节，也包括对Ln‑cRNA 的调控作用。在对口腔鳞癌的细胞及动物实验中发现，LncRNA MALAT1 能够通过对miR-125b靶点的竞争性结合，促进肿瘤细胞的增殖［9］，在对脓毒血症等严重感染模型的观察中也发现，miR-125b是LncRNA MALAT1 作用的靶点，LncRNA MALAT1能够通过对miR-125b 的调控，引起TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17 等炎性递质表达水平的变化［5］。miR-125b 可通过靶向SPDEF 表达从而抑制过敏性气道炎症反应的发生［10］。研究表明miR-125b 可参与单核细胞炎症反应发生过程，抑制炎性递质对单核细胞的趋化和激活［11］。在对本组的资料观察发现，MALAT1 在MPP 病儿中的表达上调，随着疾病的发展MALAT1 的表达量显著升高，提示MALAT1表达量升高可能促进MPP 的发生。MPP 病儿血清miR-125b 表达水平降低，而且重型病儿的miR-125b降低得更为明显。提示miR-125b 表达量降低可能与MMP的进展有关，其表达的下降可能导致气道的高反应性，进而影响呼吸道的功能及痰液的排出，加重临床症状，在病儿进入缓解期后血清的Ln‑cRNAMALAT1 水平降低，而miR-125b 水平升高，提示LncRNAMALAT1与miR-125b在MPP的发生及发展过程中发挥重要调控作用。

研究表明CRP 在全身炎症综合征等疾病中的含量增加，在机体感染后CRP 水平明显升高，其高表达量随着疾病严重程度的增加而显著升高［12-13］。本研究结果显示MPP 病儿血清CRP 水平明显升高，与上述研究结果相似。IL-6、TNF-α 属于促炎性细胞因子，其水平升高与MPP密切相关［14-17］。

本研究结果显示MPP 病儿血清IL-6、TNF-α 水平明显升高，与相关文献报道结果相似［18］。提示IL-6、TNF-α 水平升高导致的炎症反应在MPP 的病情进展中具有重要的作用。本研究结果显示MALAT1表达量与CRP、IL-6、TNF-α 呈正相关，miR-125b 的表达量与CRP、IL-6、TNF-α 呈负相关，提示血清MALAT1、miR-125b 表达与MPP 病儿免疫反应及炎症反应的发生密切。随着血清LncRNAMALAT1 水平的升高与miR-125b水平的降低，MPP 病儿感染严重程度明显增加，提示LncRNAMALAT1 与miR-125b 水平变化可通过调控炎症反应从而参与MPP发生及发展过程。

综上所述，MPP 病儿血清miR-125b 的表达水平明显升高，miR-125b 的表达水平明显降低，二者表达量变化与MPP 病情及进展密切相关，MALAT1 与miR-125b可能作为评估MPP 疾病进展的重要指标。但关于MALAT1 与miR-125b 在MPP 发生及发展过程中的作用机制仍需进一步探讨。