一种基于基因编码的高灵敏度和高时空分辨率的GRABATP探针

5'-三磷酸腺苷 (ATP) 在细胞内是能量储存分子，当被释放到细胞外，能作为嘌呤能信号分子调节多种功能（包括痛觉和睡眠等）。尽管ATP在健康和疾病中发挥着重要作用，但ATP的释放和细胞外分布机制知之甚少，尤其是在体内。北京大学李毓龙实验室研发了一种新型基因编码的ATP探针GRAB。经体外及在体动物检测，该探针可以很灵敏的检测细胞外ATP的时空动态变化。主要结果：（1）基于GRAB探针设计策略，经过系列筛选，研究者以优化的hP2Y1受体作为ATP结合支架，插入循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP，开发出新型ATP探针GRAB；（2）在体外培养的HEK293T细胞、原代神经元及星形胶质细胞中，研究者观察了ATP1.0探针的特性。ATP1.0探针的特异性好，仅对ATP和ADP有反应。ATP1.0探针能够在亚秒级别响应胞外ATP浓度的变化，其光谱特性与EGFP类似。表达ATP1.0的神经元对外源加入的ATP有～780%的信号响应，～80 nM的亲和力 (EC50)；（3）在原代培养的转染ATP1.0的海马细胞，能够检测到机械刺激及低渗透压刺激引发的内源性ATP释放。药理学实验及突变型探针实验进一步验证了ATP1.0检测信号的特异性。在不给予外界刺激时，ATP1.0也能灵敏地记录到直径约为30微米的自发性ATP释放事件，表明ATP的释放具有化学分子特异性和空间特异性；（4）通过对小鼠腹腔注射细菌脂多糖 (LPS) 诱导全身炎症，使用双光子显微镜下直接观察视觉皮层中的ATP动力学，研究者发现，LPS可以诱发大脑出现强烈和空间特异性的ATP 释放。说明ATP1.0 传感器与小鼠体内成像兼容，灵敏度和时空分辨率高；（5）研究者进一步开发了较低亲和力、但是反应动力学更快的新型 ATP探针 (ATP1.0-L)。结论：GRAB探针可以高灵敏度的检测胞外ATP的时空动态变化， 从而助力于揭示ATP信号的生理和病理生理作用。（Wu ZF, He KK, Chen Y,. A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATPand. Neuron, 2022, 110:1-13. 北京大学神经科学研究所，付苏 译，刘风雨 校）