血液NLRP3 Lp-PLA2联合CER对阿尔茨海默病的诊断价值及与UPDRS功能的相关性

朱琳琳 季 晶 朱 婷 王媛媛 陈晓宏

上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）已被临床认定为是一类原发性并伴中枢神经系统出现退行性病变的一类疾病，多发于65岁以上的老年群体，临床表现为记忆力出现进行性衰退、精神状态及行为表现出现紊乱、视空间技能障碍等［1-2］。发病后患者生存质量明显下降，给及家庭、社会带来较大负担［3］。现有的药物治疗方案在具体实施及治疗效果方面并未达到预期，因而对AD早期诊断并采取针对性的有效干预措施对提高患者生存质量、减轻其家庭负担及经济压力具有重要作用［4］。人体脑神经元的变化与脑免疫系统出现异常反应有密切联系，而这一变化是AD 患者出现脑血管损伤及发生神经性炎性反应的重要机制［5］。临床炎性反应标志物之一的脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein related phospholipase A2，Lp-PLA2）出现异常表达时是导致AD 发病的重要机制之一［6］。NOD 样受体家族蛋白3（NOD-like receptor family protein 3，NLRP3）作为具有炎症诱导性质的一类信号通路，在人体内的作用机制被认定可能与AD 发病相关［7］。铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CER）是已知可以在机体内发挥铜运输作用的α2糖蛋白，亦可促进机体内金属抗氧化酶活性升高。CER所特有的抗氧化剂作用对神经递质的有效合成带来影响，一定程度上可能会加剧神经元损伤程度［8］。上述3 项指标对AD 的诊断效能及与AD 患者认知、行为、精神状态等是否存在联系仍待商榷。本研究通过检测AD患者血清NLRP3、Lp-PLA2 及血浆CER水平并分析其诊断价值，探究其与帕金森病综合评分 量 表（unified Parkinson’s disease rating scale，UPDRS）的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料纳入2020-04—2022-04 在上海中医药大学附属曙光医院确诊并接受治疗的122例AD患者（AD患者组），另选取同期体检的58例健康志愿者为健康对照组。AD患者组中男73例，女49例，年龄66～84（73.56±5.42）岁，病程1～10（6.24±2.53）a；受教育程度：初中及以下学历者47 例，中专/高中学历者59例，大专及以上学历者17例。健康对照组所有对象临床资料均完整，且自身及家族无精神疾病史，其中男34 例，女24 例，年龄65～82（72.84±5.03）岁；受教育程度：初中及以下学历者18例，中专/高中学历者29例，大专及以上学历者11例。2组性别、年龄、受教育程度等对比均未见统计学差异（P＞0.05）。AD 患者病情程度应用临床痴呆评定量表（clinical dementia rating，CDR）评估，该量表主要对患者记忆、定向、判断、问题解决、社会事务、家庭爱好、个人料理能力等方面进行评估，其中CDR=1 为轻度AD，CDR=2 为中度AD，CDR=3 为重度AD。根据CDR 分数将AD 患者分为轻度AD 组、中度AD 组及重度AD组。

纳入标准：（1）年龄65岁及以上；（2）临床症状及诊断结果均符合《2018 中国痴呆与认知障碍诊治指南（二）：阿尔茨海默病诊治指南》中AD诊断标准［9］；（3）非其他病因导致的痴呆，如外伤、代谢性疾病、慢性酒精中毒、甲状腺功能低下、叶酸、维生素B12 缺乏等。排除标准：（1）合并精神疾病或其意识具有相关征象者；（2）合并听力、语言表达能力低下等认知功能障碍表现者；（3）合并心、肺、肝、肾等严重器质性功能障碍者；（4）合并严重消化系统疾病或恶性肿瘤者；（5）入院前14 d内接受过促智类药物或抗精神病药物治疗方案者。本研究经医院伦理委员会批准实施。

1.2 检测方法所有研究对象均于清晨空腹状态下取肘静脉血5 mL，收集到的血样置于真空采血管中，4 h内完成离心操作，参数设定为3 500 r/min，离心半径10 cm，持续时间10 min，离心完成后去上清液，采用酶联免疫吸附法测定血清Lp-PLA2、NLRP3 水平。具体步骤：检测时分别设置空白孔、标准孔及待测样品孔，其中空白样品孔加样品100 μL，其余各孔分别加标准品和待测样品，剂量各100 μL，完成操作后混匀，之后在酶标板覆膜并置于37 ℃恒温下2 h，之后去除液体并甩干，分别加检测溶液A工作液及B工作液各100 μL，A工作液加入后置于37 ℃恒温下，1 h 后甩去孔内液体并完成3 次洗板，之后再加入B工作液，仍按上述步骤完成操作。之后将底物溶液90 μL 加入各孔，在酶标板覆膜并置于37 ℃避光环境下静置待其显色，之后加入终止溶液50 μL并用酶标仪检测各孔的光密度值。

血浆CER水平测定采用化学发光法，称取约0.1 g样本，加入1 mL 蒸馏水进行冰浴匀浆。10 000×g、4 ℃离心10 min，取上清，测定OD645。全自动微粒子化学发光免疫分析仪（UniCel DxI 800）购自美国BECKMAN COULTER 公司，并应用相应配套试剂及质控品，检测过程中相关操作均按照对应说明书完成。

1.3 评估标准

1.3.1 UPDRS 功能评估：应用UPDRS 进行评估，具体包括精神、行为和情绪（UPDRS Ⅰ）评分，日常生活（UPDRS Ⅱ）评分，运动功能（UPDRS Ⅲ）评分。UPDRS每个项目分为5个等级（0～4分），受试者日常生活能力和运动功能随着评分结果的升高而降低［10］。1.3.2 认知功能评估：采用简易智力状态检查量表（mini-mental state examination，MMSE）进行评估，包括语言能力（8分）、定向力（10分）、记忆力（3分）、延迟记忆（3 分）、计算力（5 分）、结构模仿（1 分）6 个维度，总分30 分。正常：≥27 分；轻度：21～26 分；重度：≤20分［11］。

1.4 观察指标（1）对比2 组血液各指标水平；（2）对比2组MMSE评分及UPDRS功能总评分；（3）对比不同病情程度AD 患者血清各指标水平；（4）对比不同病情程度AD 患者MMSE 评分、UPDRS 功能总评分；（5）分析血清NLRP3、Lp-PLA2 及血浆CER对AD的诊断价值；（6）分析血清NLRP3、Lp-PLA2 水平，血浆CER水平与UPDRS功能的相关性。

1.5 统计学处理临床数据均纳入SPSS 26.0 软件进行统计分析，其中符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。应用ROC 曲线分析血清各指标对AD 患者的诊断价值，血清NLRP3、Lp-PLA2 及血浆CER 水平与UPDRS 功能的相关性采用Pearson 相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对比2 组患者各指标表达情况AD 患者组血清NLRP3、Lp-PLA2 水平较健康对照组均显著升高，血浆CER 水平与健康对照组比较显著降低（均P＜0.001），见表1。

表1 2组患者各指标表达情况对比 （±s）Table 1 Comparison of the expression of each index between the two groups （±s）

表1 2组患者各指标表达情况对比 （±s）Table 1 Comparison of the expression of each index between the two groups （±s）

组别AD患者组健康对照组t值P值n 122 58血清NLRP3/（ng/L）121.54±37.25 76.55±18.67 8.685＜0.001血清Lp-PLA2/（μg/L）49.91±10.29 23.24±3.76 19.118＜0.001血浆CER/（g/L）0.21±0.08 0.27±0.11 4.148＜0.001

2.2 对比2 组患者MMSE 评分、UPDRS 功能总评分 AD 患者组MMSE 评分显著低于健康对照组，UPDRS功能各项评分及总评分均显著高于健康对照组（均P＜0.001），见表2。

表2 2组患者MMSE评分、UPDRS功能总评分对比（分，±s）Table 2 Comparison of MMSE scores and UPDRS total functional scores between the two groups （scores，±s）

表2 2组患者MMSE评分、UPDRS功能总评分对比（分，±s）Table 2 Comparison of MMSE scores and UPDRS total functional scores between the two groups （scores，±s）

组别AD患者组健康对照组t值P值n UPDRS功能评分122 58 MMSE评分20.21±2.06 28.07±1.33 26.528＜0.001 UPDRS Ⅰ2.17±0.79 1.12±0.34 9.693＜0.001 UPDRS Ⅱ14.90±5.84 5.87±1.56 11.566＜0.001 UPDRS Ⅲ27.58±8.02 12.84±4.32 13.109＜0.001总分44.66±8.74 19.83±5.22 19.990＜0.001

2.3 对比不同病情程度AD 患者各指标表达水平重度AD 组血清NLRP3、Lp-PLA2 水平均显著高于轻-中度AD 组，血浆CER 水平均显著低于轻-中度AD组（均P＜0.001），见表3。

表3 不同病情程度AD患者各指标表达水平对比 （±s）Table 3 Comparison of the expressions of various indexes in AD patients with different disease degrees （±s）

表3 不同病情程度AD患者各指标表达水平对比 （±s）Table 3 Comparison of the expressions of various indexes in AD patients with different disease degrees （±s）

组别轻-中度AD组重度AD组t值P值n 68 54血清NLRP3/（ng/L）108.12±32.27 138.45±40.06 4.632＜0.001血清Lp-PLA2/（μg/L）40.05±7.62 62.33±12.51 12.130＜0.001血浆CER/（g/L）0.24±0.08 0.17±0.05 5.615＜0.001

2.4 对比不同病情程度AD 患者MMSE 评分、UPDRS功能总评分重度AD组MMSE评分显著低于轻-中度AD 组，UPDRS 功能各项评分及总评分均显著高于轻-中度AD组（均P＜0.001），见表4。

表4 不同病情程度AD患者MMSE评分、UPDRS功能总评分对比（分，±s）Table 4 Comparison of MMSE scores and UPDRS total functional scores in AD patients with different disease degrees （scores，±s）

表4 不同病情程度AD患者MMSE评分、UPDRS功能总评分对比（分，±s）Table 4 Comparison of MMSE scores and UPDRS total functional scores in AD patients with different disease degrees （scores，±s）

组别轻-中度AD组重度AD组t值P值n UPDRS功能评分/分68 54 MMSE评分23.87±2.26 17.31±2.07 16.523＜0.001 UPDRS Ⅰ1.86±0.71 2.57±0.92 4.672＜0.001 UPDRS Ⅱ12.18±3.27 18.33±3.61 9.740＜0.001 UPDRS Ⅲ24.46±7.18 31.52±8.32 4.942＜0.001总分38.50±7.46 52.42±9.05 9.042＜0.001

2.5 血清NLRP3、Lp-PLA2及血浆CER水平对AD的诊断价值采用ROC 曲线分析显示，联合检测曲线下面积明显高于NLRP3、Lp-PLA2、CER 单项检测的曲线下面积（AUC=0.914），见表5、图1。

图1 NLRP3、Lp-PLA2、CER单项及联合检测对AD诊断价值的ROC曲线Figure 1 ROC curve of NLRP3, Lp-PLA2, CER single and combined detection in the diagnosis of AD

表5 血清NLRP3、Lp-PLA2及血浆CER单项及联合检测对AD的诊断价值Table 5 The diagnostic value of serum NLRP3, Lp-PLA2 and plasma CER single and combined detection for AD

2.6 血清NLRP3 及Lp-PLA2、血 浆CER 水平与UPDRS 功能的相关性采用Pearson 相关分析显示血清NLRP3、Lp-PLA2 水平均与UPDRS 功能评分呈正相关，血浆CER水平与UPDRS功能评分呈负相关（均P＜0.05），见图2～4。

图2 血清NLRP3水平与UPDRS功能评分的相关性Figure 2 Correlation between serum NLRP3 level and UPDRS functional score

3 讨论

中国脑血管相关疾病患者人数呈明显升高趋势，AD 发病率也随之升高，给患者的生命安全及生存质量带来严重不良影响［12，20-22］。现阶段针对AD患者只能通过其出现明显痴呆症状后基于营养神经、记忆改善等方案对症治疗，但临床效果并不显著，只能减缓患者脑功能衰退程度，很难恢复认知功能［13，23-25］。实验室指标水平的变化往往先于临床症状的出现，提示明确有效的实验室指标对机体病变具有更高的敏感度和特异性［14，26-27］。目前多数学者认为类胰岛素生长因子1 可作为AD 的早期评估指标并在临床应用，但该指标表达水平受多种因素影响，如动脉粥样硬化的发生也会使该指标异常升高，这一现象的出现使得该指标在临床评估中的实际准确率降低，因此临床上一直致力于寻找新的实验室指标。

图3 血清Lp-PLA2水平与UPDRS功能评分的相关性Figure 3 Correlation between serum Lp-PLA2 level and UPDRS functional score

图4 血浆CER水平与UPDRS功能评分的相关性Figure 4 Correlation between plasma CER levels and UPDRS functional score

NLRP3 是人 体10 号染色体1q44 上的NLRP3 基因编码的蛋白质，该蛋白质与促进细胞凋亡活性提升的微粒蛋白、半胱天冬酶共同组成NLRP3 炎症小体，被认为可以提高促炎蛋白酶活性，是激活机体炎性反应的重要机制之一。NLRP3 对激活肿瘤坏死因子-α的分泌具有促进作用，而这一机制也是促成T 淋巴细胞激活、实现并促进机体免疫应答，加剧炎性反应，进而诱导神经细胞凋亡活性上升的重要机制［15］。本研究显示，与健康人群相比，AD 患者血清NLRP3 水平明显升高，且随着患者病情程度的加剧而呈现升高态势，进一步证实血清NLRP3 加剧炎性反应并对患者病情发展带来不良影响。

Lp-PLA2 是一种由巨噬细胞、淋巴细胞分泌而成的丝氨酸脂酶［16］。有学者围绕脑组织缺血缺氧病变机制进行研究，发现此时Lp-PLA2 可以通过对氧化型的低密度脂蛋白进行水解来提高各种促炎因子的表达水平，促炎介质刺激单核-巨噬细胞进一步转变成泡沫细胞，凋亡的泡沫细胞过度合成是造成动脉粥样硬化性斑块堆积的重要因素。本研究显示AD 患者血清Lp-PLA2 水平随病情程度的加剧而呈现升高态势，分析原因可能为Lp-PLA2 是促进蛋白酶释放的重要机制，而这也是促进斑块纤维帽胶原基质降解的重要因素，很可能引发动脉粥样硬化斑块破裂，进而加剧脑组织局部循坏不畅，导致AD 的发生［17］。

本研究纳入的AD 患者血浆CER 水平与健康人群相比明显降低，且随着患者病情程度的加剧呈下降趋势。师强等［18］研究发现AD 患者机体内影响心脑血管及相关代谢风险因子呈异常高表达，这些均是促成氧化应激生成的负氧离子堆积的重要机制，提示AD 病理生理机制受氧化应激反应的影响。CER 作为人体内一列重要的抗氧化因子，已被临床认为是可以减轻机体氧化应激的重要因子，也成为评估机体内氧化应激状态的重要检测标志物［19］。本研究显示，随着患者病情加剧，血浆CER水平有下降的趋势，进而导致认知功能持续下降，提示CER 与AD发病及病情进展有密切联系。

本研究发现血清NLRP3、Lp-PLA2 联合血浆CER检测模式对AD的诊断效能较高，提示3项指标可成为早期诊断AD的重要标志物。本研究证实AD患者的认知功能随着病情程度的加剧而衰退，患者精神、行为、日常生活、运动功能与健康人群存在显著差异。上述3项血液指标与UPDRS功能均显著相关，表明患者各项功能越差，炎症状态、氧化应激反应越严重，提示后续可将NLRP3、Lp-PLA2、CER作为AD患者病情严重程度的评估指标。

AD 患者血清NLRP3、Lp-PLA2 及血浆CER 水平较健康人群异常表达，3项血液指标在不同病情程度患者的表达也存在显著差异，与UPDRS 功能密切相关，提示其后续可成为早期诊断AD 的重要指标，对评估AD患者UPDRS功能也具有较大的临床意义。