H19基因多态性对上皮性卵巢癌患者铂类化疗应答和预后的影响

陈 欢 ,王 静 ,高荣荣

河北省衡水市人民医院:1.妇科;2.儿科,河北衡水 053000

卵巢癌(EOC)是妇科常见的癌症,也是全球妇科恶性肿瘤致癌死亡的主要原因。目前,EOC的主要治疗方法是手术结合铂基疗法[1]。在EOC 治疗方面,临床上取得了较大进步,但铂基疗法抗药性(PR)也出现了进展,这导致晚期疾病患者的5 年总生存率较低[2-3]。母体表达的印记长链非编码RNA(lncRNA)基因H19,在出生后显著下调,然后在肿瘤中过表达。先前的研究报道显示,H19在各种癌症的生物学进程中起着至关重要的作用,包括乳腺癌、胃癌、肝细胞癌和EOC[3]。已有研究表明,H19 基因的异常表达与肝母细胞瘤、生殖细胞肿瘤、食道癌和肾细胞癌在内的多种恶性肿瘤有关[4]。在人的头颈部鳞状细胞癌中,H19基因座上印迹丢失,而H19表达的上调是获得性顺铂抗药性的重要和关键因素。lncRNA 基因中的单核苷酸多态性(SNP)可能会显著影响基因表达和功能,从而导致肿瘤易感性和化学治疗敏感性的改变。已有证据表明,H19基因的遗传变异可能会改变多种肿瘤化疗的敏感性,且在中国女性中,H19 rs2839698 与结直肠癌和胃癌的患病风险增加相关[5]。此外,最近的证据表明,H19基因的SNP与肺癌患者铂类化疗反应显著相关[6]。目前,EOC患者基于铂类化疗反应与H19基因的SNP关系尚不清楚。本研究拟探讨H19基因多态性对上皮性EOC 患者铂类化疗应答和预后的影响,为上皮性EOC 治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年9月至2019年12月本院136例接受铂类化疗的上皮性EOC 为研究对象。收集患者2 mL 血液标本用于H19多态性的基因分型。所有患者均接受化疗,化疗方案为175 mg/m2紫杉醇+卡铂剂量,卡铂剂量(mg)=所设定的曲线下面积[AUC,mg/(mL· min)]× [肌酐清除率(mL/min)+25],AUC取值为5 mg/(mL·min),肌酐清除率=(140-年龄)×1.23×0.85/(血清肌酐值)[7],每3周进行1次治疗,共6个周期。根据患者对治疗的反应,将患者分为两类:(1)敏感应答组66例:在随访期内达到完全反应并保持缓解的患者;(2)无敏感应答组70例:患者在治疗期间或治疗后疾病复发。本研究得到本院伦理委员会的批准。

纳入标准:(1)患者年龄大于18岁;(2)患者在组织学上证明为上皮性EOC;(3)重要脏器器官功能正常;(4)获得患者及家属知情。排除标准:(1)患者依从性差;(2)患有心血管疾病。(3)早期使用铂类化学疗法治疗。

1.2 方法 抗凝管收集血液标本,使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)将200 μL 全血样品用于全基因组DNA 分离,检测H19基因中4种常见的SNP(rs3741206 T/C、rs3842761 C/G、rs4244809 A/G、rs7924316 G/T),采用多重PCR 对SNPs进行基因分型,包括H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G、rs4244809 A/G、rs7924316 G/T。引物序列如下:rs3741206,正向5'-TGA TCT CGA TGC TAC GTC GTA GCT AGC TAG CTA GCT-3',反向5'-TGC GAG AGC TAG CTA GCT AGT GAT CGA TGT AG-3'。rs3842761,正向5'-TGA CGC TAG TCA GTC GAT GCT AGC TAG CTA GCT AGT-3',反向5'-TGC TAG CTA GTC GAT GTA GCT AGT CGA TCG ATC GT-3'。rs4244809,正向5'-CGA GTA GCT GAT CGA TGC TAG TCG ATC GTA GCT AGC-3',反向5'-TGC TAG TCG ATC GTA GCT AGC TGA TCG ATC GTA GCT A-3'。rs7924316,正向5'-TGA CGT AGC TGA TCG ATC GTA GCT AGC TAG TCG AT-3',反向5'-TGG GCT AGA TGC TAG GGA TCG TAG CTG ATC GTG-3'。使用多基因特异性引物通过PCR 对高质量的基因组DNA 样品进行基因分型,富集特定的SNP和索引引物,在离子质子系统(Life Technologies)上进行大规模并行测序。同时收集所有研究对象的一般资料,包括肿瘤最大径、国际妇产科协会(FIGO)分期、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、复发情况等。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0对数据进行分析。计数资料采用百分数表示,组间比较采用χ2检验;采用多因素Logistic回归分析探讨H19基因型与化疗敏感性的关系,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型与上皮性EOC 临床病理特征、预后的关系 H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型与年龄无关(P>0.05);与肿瘤最大径、FIGO 分期、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、复发有关,且肿瘤最大径≥5 cm、FIGO分期越高、淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、有复发,H19 rs3741206 CT/TT、rs3842761 CC/CG 基因型比例越高(P<0.05)。见表1。

表1 H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型与上皮性EOC临床病理特征的关系[n(%)]

2.2 H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型与上皮性EOC 临床病理特征与预后复发关系 H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型与年龄、肿瘤最大径、FIGO 分期、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、复发无关(P>0.05)。见表2。

表2 H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型与上皮性EOC临床病理特征的关系[n(%)]

续表2 H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型与上皮性EOC临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 H19基因型与上皮性EOC 铂类化疗敏感性的关系 H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型与上皮性EOC 铂类化疗敏感性有关(P<0.05),且上皮性EOC 铂类化疗敏感性越高,H19 rs3741206 CC 基因型、rs3842761 GG 基因型比例越高(P<0.05)。H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T 基因型与上皮性EOC铂类化疗敏感性无关(P>0.05)。见表3。

表3 H19 基因型与上皮性EOC铂类化疗敏感性的关系分析[n(%)]

2.4 H19基因多态性与上皮性EOC 患者铂类化疗敏感性的多因素Logistic回归分析 以上皮性EOC患者铂类化疗敏感性为因变量(敏感=0,不敏感=1),以H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G、rs4244809 A/G、rs7924316 G/T基因型为自变量进行多因素Logistic逐步回归分析,结果发现H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型为上皮性EOC 患者铂类化疗敏感性的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响H19基因多态性对上皮性EOC患者铂类化疗敏感性的多因素Logistic回归分析

3 讨论

目前临床主要采用外科手术和化疗结合的方式对EOC 进行治疗,卡铂已广泛用于EOC 治疗,但患者可能会对卡铂治疗产生耐药性并最终导致化疗失败。卡铂通过形成DNA/铂复合物来抑制EOC 细胞中的DNA 复制和转录,从而导致DNA 断裂,编码错误,并最终通过凋亡导致癌细胞死亡[8]。

H19负责消除DNA的长链损伤并恢复功能性双链DNA(dsDNA),这种多功能的DNA 修复系统可识别基于铂类治疗引起的DNA 损伤并恢复原始DNA分子[9]。据报道,在卡铂耐药性EOC 细胞系或新鲜组织中,H19蛋白mRNA的水平升高,提示H19 蛋白复合物在卡铂治疗结果中具有至关重要的作用。H19基因在第19条染色体的长臂上,位置为13.32,已有研究报道了H19基因中具有多个SNP[10]。有学者报道了8 个常见SNP(rs11615:C>T,位置45、420、395;rs3212986:C>A,位 置45、409、478;rs735482:A>C,位置45、408、744;rs2336219:A>G,位置45、409、148;rs3212980:A>C,位置45、413、183;rs3212964:G>A,位置45、417、538;rs3212961:C>A,位置45、419、065;rs2298881:C>A,位置45、423、658),这些H19多态性在不同的DNA 修复相关疾病中起重要作用[11]。

H19基因区域包括2 个基因:H19,反义H19(H19AS)。本研究包括了 H19的4 种基因型(rs3741206 T/C、rs3842761 C/G、rs4244809 A/G、rs7924316 G/T)。目前,有关SNP与人类疾病关系研究罕见。既往研究曾观察到散发性Beckwith-Wiedemann综合征患者H19的rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 单倍型(CT/TT 基因型、CC/CG 基因 型)频率增加,这与孕妇KvDMR1等位基因特异性甲基化的丧失有关[12-13]。已有研究表明,H19的rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 与孕妇妊娠晚期的葡萄糖水平升高和出生时胎盘中H19的水平有关[14]。还有研究表明,H19在耐药细胞株如肝癌和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞及对卡铂耐药的EOC细胞株中过表达[15-16]。据报道,H19过表达是通过调节谷胱甘肽代谢实现的,是癌症患者对卡铂耐药的潜在机制[17-18]。此外,H19 7924316 T 等位基因携带者由于较高的H19 RNA 表达而对铂类化学疗法反应的可能性较小,肺癌患者中H19 rs4244809与铂类化学疗法相关[19-20]。然而,本研究未观察到这2种H19基因型与EOC患者铂类化学疗法的敏感性有关。

为了进一步确定H19 基因型与EOC 患者的年龄、分期、组织学、肿瘤等级、复发情况之间的关联,本研究分析了H19的SNP等位基因的频率和基因型差异,结果发现H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型与肿瘤最大径、FIGO 分期、淋巴血管间隙浸润、淋巴结转移、复发有关,且肿瘤最大径≥5 cm、FIGO分期越高、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、有复发,rs3741206 CT/TT 基因型、rs3842761 CC/CG 基因型比例较高(P<0.05)。这提示H19与EOC患者临床病理、预后有关。而EOC 是一类源自各种组织学亚型的异质性肿瘤,组织学和肿瘤分级都是EOC预后的独立影响因素。此外,不同的组织学类型和肿瘤等级具有多种遗传和表观遗传异常,这也可能导致不同的结果。有学者在透明细胞癌中已经发现了抑癌基因ARID1A和TGFⅡ的高频率突变,而在子宫内膜样癌中发现了H19s3741206突变及BAF250a(ARID1A)丢失[17],这些机制探讨将在后续研究中进行。

本研究同时也发现,H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型与上皮性EOC 铂类化疗敏感性有关,且H19 rs3741206 CC、rs3842761 GG 基因型比例越高,上皮性EOC 铂类化疗敏感性越高(P<0.05);可能这两种基因型发挥协同功能,这将导致DNA 修复活性增强,最终对卡铂介导的治疗反应的敏感性增加。此外,本研究显示H19 rs4244809 A/G、rs7924316 G/T基因型与上皮性EOC铂类化疗敏感性无关(P>0.05),而H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G基因型为上皮性EOC患者铂类化疗敏感的危险因素(P<0.05)。这表明H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G基因型可作为预测EOC卡铂化疗敏感性的潜在生物标志物。

综上所述,H19 rs3741206T/C、rs3842761 C/G基因型与上皮性EOC 患者临床病理特征与预后、化疗应答有关;H19 rs3741206 T/C、rs3842761 C/G 基因型有望作为预测EOC卡铂化疗治疗敏感性的生物标志物。