罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾幼虫的毒力及生长发育的影响

赵宗祥,王明伟,李蕾,吴俊南,王梦茹,李世广

罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾幼虫的毒力及生长发育的影响

赵宗祥,王明伟*,李蕾,吴俊南,王梦茹,李世广**

安徽农业大学 植物保护学院;作物有害生物综合治理安徽省重点实验室, 安徽 合肥 230036

为明确昆虫病原真菌对草地贪夜蛾的致病力，开展草地贪夜蛾的生物防治，本实验用不同浓度的罗伯茨绿僵菌AAU-4菌株的孢子悬浮液对草地贪夜蛾2龄幼虫以浸渍法进行了毒力测定。结果表明，AAU-4菌株对草地贪夜蛾2龄幼虫具有较强的致病力，浓度为1.0×108孢子/mL的LT50=7.18 d，11 d的累积校正死亡率为(70.37±6.73)%，且对被侵染而未致死的草地贪夜蛾幼虫体重、体长、化蛹率、成虫羽化率、产卵量、卵的孵化率等均产生了不同程度的影响，具有明显的亚致死效应。处理组2龄幼虫存活至6龄时体重为(0.31±0.01) g，对照组6龄幼虫体重为(0.44±0.00) g；处理组存活至6龄的幼虫体长为(3.18±0.04) cm，对照组6龄幼虫体长为(4.25±0.06) cm；处理组幼虫的化蛹率仅为(59.00±1.87)%，对照组幼虫化蛹率高达(91.00±1.00)%；处理组幼虫存活至蛹的羽化率为(55.80±4.96)%，对照组蛹的羽化率为(91.75±4.96)%；处理组幼虫存活至成虫的平均产卵量为(728.80±16.16)个，对照组成虫的平均产卵量为(951.30±23.29)个；处理组幼虫存活至成虫所产卵的校正孵化抑制率为(38.48±2.69)%，而对照组成虫所产卵未见孵化抑制现象；处理组与对照组间在上述6个指标上均存在显著性差异。因此，罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾的生长发育及繁殖均具有显著抑制效果，可以减少下一代的虫口数量，具有开发为生防制剂应用于草地贪夜蛾绿色防控的潜力。

草地贪夜蛾; 罗伯茨绿僵菌; 毒力测定; 生物防治

草地贪夜蛾(J.E. Smith)，属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，原产地位于美洲热带和亚热带地区[1]，具有繁殖力强、扩散蔓延速度快的特点[2]。2016年1月入侵非洲地区后，很快蔓延到撒哈拉以南的44个国家[3]，2019年1月入侵中国云南，2020年随季风向北迁移至长江、黄河流域和东北地区，对我国多地农作物都造成了巨大的影响[4]。

对草地贪夜蛾的防治方法主要包括物理防治、化学防治和生物防治三大类。相较于化学农药的污染问题，以菌治虫的生物防治方法更为环保、安全，且虫生真菌易在自然界中宿存并形成害虫流行病[5]，对防控草地贪夜蛾具有极大的开发潜力[6]。众多研究表明：绿僵菌对鳞翅目、直翅目(Orthoptera)、和鞘翅目(Homoptera)等200多种害虫均有明显的防治效果，其中包括危害农林作物的小菜蛾、菜青虫、蚜虫、蛴螬、椰心叶甲、蝗虫、德国小蠊、褐飞虱、松墨天牛等[7]。张柱亭[8]等在黔东南地区发现绿僵菌可侵染各龄期草地贪夜蛾幼虫。马艳[9]等在大理大田调查中也发现绿僵菌能在自然条件下侵染各龄期草地贪夜蛾幼虫，并对3～4龄草地贪夜蛾幼虫的感染力最高，田间自然感染率为75%，能有效降低草地贪夜蛾对作物产量的影响。

虫生真菌在害虫生物防治中应用十分广泛，对人类、环境和非靶生物的危险性非常低[10]。罗伯茨绿僵菌来源于自然界，其生活方式多样[11]，可通过多种方式寄生到昆虫体内。罗伯茨绿僵菌孢子悬浮液的单独使用虽存在杀虫作用缓慢等局限性问题，但在整个侵染过程中明显降低了草地贪夜蛾幼虫的生活力，并对其正常生长发育造成较大影响。本实验评价了不同浓度AAU-4分生孢子悬浮液对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力及生长发育和繁殖的影响，为后期开展罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾致病机理研究并将其开发为生物制剂应用于草地贪夜蛾绿色防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株罗伯茨绿僵菌AAU-4由安徽农业大学作物有害生物综合治理安徽省重点实验室提供。

1.1.2 供试虫源草地贪夜蛾虫源采自安徽农业大学大杨店镇实训基地未喷药的玉米田中，用安徽农业大学植物保护学院温室中未喷药的非转基因玉米嫩叶进行饲养，经2代饲养后选取虫体状况基本一致的2龄幼虫进行实验。

1.1.3 培养基的制备制备SDAY培养基：称取葡萄糖40 g、琼脂20 g、蛋白胨10 g和酵母粉10 g，定容1 L，在121 ℃的立式压力蒸汽灭菌器中灭菌20 min。

1.1.4 供试药剂与仪器0.05% Tween-80(西陇化工股份有限公司)、琼脂(国药公司)、葡糖糖(国药公司)、恒温培养箱(上海智诚)、漩涡震荡器(江苏金坛国胜)、立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)、超净工作台(苏州净化)、电子显微镜(Nikon)、电子天平(上海METTLER TOLEDO)。

1.2 实验方法

1.2.1 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液的配制刮取成熟的罗伯茨绿僵菌AAU-4分生孢子，并在0.05% Tween-80水溶液中进行溶解，在显微镜下采取血球计数板计数的方法，配制1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL浓度的孢子悬浮液。

1.2.2 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力测定参照1.2.1 所述方法配置4个浓度梯度的孢子悬浮液，每浓度梯度设置3组重复，每组选取20头生长状态基本一致的2龄幼虫，在各梯度孢子悬浮液中浸渍10 s，设置0.05% Tween-80水溶液作为空白对照组(CK)。在室温为(25±2) ℃、相对湿度(75±5) %、L:D=12 h:12 h 的养虫室中进行饲养，每24 h统计幼虫死亡数量一次。

1.2.3 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液对草地贪夜蛾生长发育及繁殖的影响按1.2.1中所述方法配制4个浓度梯度的孢子悬浮液，每组处理20只2龄幼虫，每组重复3次，设置0.05% Tween-80水溶液作为空白对照组。供试虫体的处理方式和饲养环境同1.2.2，每24 h记录草地贪夜蛾的生长变化状态：虫体重量、长度、蛹重、化蛹率、羽化率及其产卵量和卵的孵化率。及时清理废弃物，更换饲料。对羽化出的草地贪夜蛾成虫，饲喂其浓度为10%的蜂蜜水，以保证成虫期的营养补充。

1.3 数据处理与统计分析

孵化率(%)=(孵化卵数/处理总卵数)× 100

孵化抑制率(%) =(未孵化卵数/处理总卵数)×100

校正孵化抑制率(%) = [(处理组孵化抑制率-对照组孵化抑制率)/(1-对照组孵化抑制率)]×100

死亡率(%)＝(处理组死亡总虫数/处理组总虫数)×100

校正死亡率(%)＝[(处理组死亡率-对照组死亡率) / (1-对照组死亡率)]×100。

实验数据的分析与处理采用采用Excle 2007和DPS 9.5版本，计算校正孵化抑制率、累计校正死亡率、毒力回归方程、相关系数、LT50、卡方值及95%置信限，其余数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力

由表1可知，罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力随着孢子悬浮液浓度的增加而增加，最低浓度1.0×105孢子/mL的累积校正死亡率不及20%，最高浓度1.0×108孢子/mL对幼虫的累计校正死亡率达到了(70.37±6.73)%，且毒力回归方程为=3.1462+2.1654。低浓度与高浓度孢子悬浮液处理的草地贪夜蛾幼虫累积校正死亡率间存在显著性差异。

表 1 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力

注：表中数据为平均值±标准误，同列不同小写字母表示采用Duncan's新复极差统计法进行比较，差异显著(<0.05)。下同。

Note: The data in the table were mean ± SE. Different letters in each column indicated significant difference (<0.05) by Duncan's multiple range tests. The same as follows.

2.2 罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾2龄幼虫虫体外部形态的影响

实验表明，被菌株AAU-4侵染的草地贪夜蛾2龄幼虫与对照组相比，其虫体外部形态在侵染初期无明显变化，幼虫在取食量和活动力方面均有所降低，但较对照组不明显。随着虫龄的增加，幼虫开始出现明显颤搐和拒食的现象，存活至6龄的幼虫在体表颜色(图B、图D)、虫体重量(表2)和虫体长度(图H、表3)上与对照组均存在显著性差异。以1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL的孢子悬浮液侵染但未死亡的6龄幼虫为例：CK对照组中长至6龄的虫体重量和长度分为(0.44±0.00) g和(4.25±0.06) cm，经1.0×108孢子悬浮液处理的长至6龄的草地贪夜蛾幼虫体重和体长分别为(0.3131±0.01) g和(3.18±0.04) cm。同时，处理组的幼虫在5、6龄时虫体畸形的情况也逐步增多。实验中受侵染的虫体腹部的不同位置呈白色透明状，前胸背板等部位发黑且身体僵硬(图D、图E)，被侵染死亡后，虫体表面开始出现明显菌丝，分生孢子逐步覆盖在草地贪夜蛾虫体表面(图F)。

图 1 AAU-4对草地贪夜蛾生长发育的影响

A(背部) 经0.05% Tween-80水溶液处理存活至6龄的对照组幼虫

B(背部) 经1.0×107孢子/mL罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液处理存活至6龄的草地贪夜蛾幼虫

C (侧面) 经0.05% Tween-80水溶液处理存活至6龄的对照组幼虫

D (侧面) 1.0×107孢子/mL罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液侵染存活至6龄的草地贪夜蛾幼虫

E 1.0×108孢子/mL罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液侵染存活至6龄的草地贪夜蛾幼虫

F 经1.0×108孢子/mL罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液侵染形成的草地贪夜蛾僵虫

G 经0.05% Tween-80水溶液处理的对照组幼虫

H 经1.0×107孢子/mL罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液处理对存活至6龄的草地贪夜蛾幼虫体重、长度的影响

I 经0.05% Tween-80 水溶液处理的对照组幼虫所化的蛹形态正常

J 经1.0×108孢子/mL罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液处理的草地贪夜蛾幼虫所化的蛹变为畸形

表 2 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液侵染存活至5、6龄的草地贪夜蛾幼虫体重的变化

表 3 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液侵染存活至5、6龄的草地贪夜蛾幼虫体长的变化

2.3 罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾化蛹率的影响

经1.2.2中处理的草地贪夜蛾2龄幼虫在药后11 d开始陆续化蛹，如表4可知，对照组的化蛹率为(91.00±1.00)%，羽化率为(91.75±1.31)%，而经1.0×108孢子/mL孢子悬浮液侵染的2龄幼虫的化蛹率和羽化率仅为(59.00±1.87)%和(55.80±4.96)%。经1.0×106和1.0×107孢子/mL孢子悬浮液侵染的幼虫化蛹率和成虫羽化率差异不明显，但经处理的幼虫中出现了大量的畸形蛹(图J)。

表 4 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液侵染对草地贪夜蛾化蛹率和羽化率的影响

Table 3 Effects of Metarhizium robertsiis AAU-4 spore suspension on pupal weight, pupation rate and emergence rate of Spodoptera frugiperda

2.4 罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾成虫产卵量、卵的孵化率的影响

经1.0×108孢子/mL孢子悬浮液侵染的2龄幼虫，其成虫平均产卵量为728.80个，与对照组及低浓度处理间存在显著性差异。不同浓度孢子悬浮液侵染的校正孵化抑制率最高为(38.48±2.69)%，最低为(10.92±1.92)%，由表5可明显看出，随着孢子悬浮液浓度的增加，低浓度和高浓度处理的校正孵化率上具有显著性差异。

表 5 罗伯茨绿僵菌AAU-4孢子悬浮液侵染对草地贪夜蛾产卵量和卵的孵化率的影响

3 讨 论

罗伯茨绿僵菌来源于自然，生活方式多样，易在自然界中宿存并形成害虫流行病[11]，可以通过多种侵染方式侵染各类口器害虫并在害虫体表或体内进行寄生[12]，从而杀死害虫，达到较好的防治效果。郑亚强[13]等发现，1.0×108个/mL孢子浓度的莱氏绿僵菌孢子悬浮液对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率达100%。雷妍圆[14]等同样发现，1.0×109孢子/mL的绿僵菌对草地贪夜蛾2龄幼虫7 d的累计校正死亡率达100%，LT50仅为3.030 d。Akutse等[15]用20株昆虫病原真菌(绿僵菌14株和球孢白僵菌6株)对草地贪夜蛾进行了毒力测定，结果发现所选取的菌株仅对卵的孵化和1、2龄幼虫具有较好防效，部分真菌药剂对高龄草地贪夜蛾幼虫的防治效果不理想[16,17]。本次实验采用浸渍法对草地贪夜蛾2龄幼虫进行了毒力测定[15]，结果表明，在处理后第11 d，1.0×108孢子/mL的罗伯茨绿僵菌AAU-4对草地贪夜蛾2龄幼虫最高累积校正死亡率为(70.37±6.73a)%，相较于Thomazoni等[18]对草地贪夜蛾3龄幼虫实验中的最高致死率44.5%，已有显著性提升。1.0×108孢子/mL浓度的AAU-4对草地贪夜蛾2龄幼虫的LT50为7.18 d，而陈自宏等[19]实验中测得的13株白僵菌对草地贪夜蛾幼虫的LT50在2.3 d ～10.3 d之间。以上研究表明，AAU-4对草地贪夜蛾2龄幼虫具有较强的致病力。AAU-4虽不能迅速将草地贪夜蛾幼虫致死，但该菌株在草地贪夜蛾幼虫的生长发育和成虫繁殖力上的影响同样也是评价该菌对草地贪夜蛾防治效果的依据之一[20]。在毒力测定实验中，观察到经AAU-4侵染后，草地贪夜蛾幼虫5、6龄时的虫体重量、长度、化蛹率、羽化率及其成虫的产卵量与卵的孵化率均显著低于对照组。产生该现象的主要原因可能是AAU-4菌株侵染并在草地贪夜蛾体表或体内定殖发育的过程中消耗了虫体大量的养分，且菌株生长过程中产生的次生代谢产物对草地贪夜蛾幼虫的神经、消化系统产生了不同程度影响[21]，降低了草地贪夜蛾的生活力和取食量，从而导致幼虫在菌株处理后期产生明显颤搐和畸形的现象产生[16,22]。本实验发现，被AAU-4菌株侵染后期的幼虫体表发黑，这与彭国雄[23]等的研究发现一致。实验中死亡的虫体，在不保湿处理的情况下虫体表面极少会自然产生菌丝，这与龙秀珍[24]等发现的莱氏绿僵菌侵染草地贪夜蛾幼虫的研究结果类似。综上，本实验研究结果表明罗伯茨绿僵菌AAU-4具有开发为生防制剂应用于草地贪夜蛾绿色防控的潜能。

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Virulence and Effects ofAAU-4 on the Growth and Development of Larvae of

ZhAO Zong-xiang, WANG Ming-wei*, LI Lei, WU Jun-nan, WANG Meng-ru, LI Shi-guang**

230036,

In order to clarify the virulence of entomopathogenic fungi againstand carry out biological control of, the virulence ofAAU-4 conidial suspensions to the 2nd instar larvae ofwas determined. The results showed that AAU-4 had a strong virulence to the 2nd instar larvae. The LT50was 7.18 d at 1.0×108conidia/mL, and the cumulative adjusted mortality was (70.37±6.73)% at 11 d. In addition, it had obvious effects on the body weight, body length, pupation rate of the infected larvae, adult emergence rate, oviposition quantity and the egg hatching rate of the treatment group. The body weight of the 2nd instar larvae in the treatment group was (0.31±0.01) g, and that of the 6th instar larvae in the control group was (0.44±0.00) g. The body length of the 6 instar larvae in the treatment group was (3.18±0.04) cm, and that in the control group was (4.25±0.06) cm. The rate of pupation was only (59.00±1.87)% in the treatment group and (91.00±1.00)% in the control group. The emergence rate was (55.80±4.96)% in the treatment group and 91.75±4.96)% in the control group. The average number of eggs laid in the treatment group was (728.80±16.16), and 951.30±23.29) in the control group. The corrected hatching inhibition rate of the eggs laid by the adult developed from the larvae in treatment group was (38.48±2.69)%, and that of the eggs laid by the adults in control group was 0. There were significant differences between the treatment group and the control group in the above six indicators. Therefore,AAU-4 has a significant inhibitory effect on the growth, development and reproduction of, and can reduce the population number of the next generation of, which has the potential of developing biological control agents for the green control of.

;; toxicity measurement; biological control

S476+.12

A

1000-2324(2022)01-0060-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.01.010

2021-10-11

2021-11-04

安徽省自然科学基金(1908085MC94)

赵宗祥(1995-),男,硕士研究生,主要从事有害生物绿色防控等研究. E-mail:1215344921@qq.com

王明伟(1998-),本科生,专业方向:植物保护. E-mail:430857572@qq.com

Author for correspondence. E-mail:lsg815@163.com