小分子化合物延缓间充质干细胞衰老的研究进展

冯笑梅 ,郝兴瑶,文 勇

经过50多年的研究，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)已被证明是再生医学和组织工程领域中用途广泛、使用频率较高的成体干细胞，具有广阔的应用前景[1]，在口腔组织再生中也被大量运用[2]。然而多种体内外诱因能够造成其衰老，随着衰老相关基因和表观遗传的变化逐渐积累，子代细胞数量锐减、质量降低，最终导致干细胞应用效率下降，若体内长期积聚衰老细胞则会导致机体老化甚至发生衰老相关疾病[3]。

基于此，亟需适当的治疗手段重焕衰老细胞生机，提升再生医学疗效，延长人类健康寿命。目前，已知多种相关干预措施，包括细胞重编程[4]、外泌体治疗[5]、小分子化合物治疗等，且均在生物模型中展现出不菲的治疗价值。但由于大部分方法受到伦理限制，难以实现安全化、标准化监测，不太可能转化于临床。因此，探索一种简易、安全、有效的延缓间充质干细胞衰老的方法具有重要的实践与临床意义，其中，小分子化合物的应用逐渐成为近年的研发热点。

1 MSCs衰老概论

1.1 MSCs

MSCs具有自我更新及多向分化潜能[1]，组织来源广泛，可以自骨髓、脐带、牙周、牙髓等部位采集[6]。其丰度较低，且通常处于静止状态，但能在一定刺激下重新进入细胞周期，确保子代干细胞的持续供应[7]，并能在不同诱导条件下分化为特定细胞，通过迁移、归巢修复组织功能[8]。

1.2 细胞衰老的定义、诱因

细胞衰老是一种可诱导、持久的细胞周期停滞现象[3]，诱发因素包括：DNA损伤[9]、持续DNA复制压力造成的端粒酶缩短[10]、线粒体功能障碍[11]、氧化应激[12]、干细胞自噬失调[13]等(图1)。根据诱因可大致将MSCs的衰老类型分为3类：复制性衰老、功能失调性衰老、应激性衰老。

图1 常见的间充质干细胞衰老诱因Fig.1 Common causes of MSCs’ senescence

1.3 衰老MSCs的特征

MSCs的衰老是一种复杂的、动态应对潜在有害应激的综合反应机制[3]，相关特征在此过程中呈现多样性，涉及的分子、表型均可作为鉴定细胞衰老的标志物。

首先，细胞形态变化最显著，由于动态肌动蛋白细胞骨架基因簇表达下调，肌动蛋白更新放缓[14]，衰老MSCs由原本典型的纺锤状，转变为成纤维细胞样，体积变大、形态变扁[15]。而最明确的特征是细胞周期停滞——各类诱因激活p53/p21CIP1和p16INK4a/Rb肿瘤抑制信号通路启动衰老，下游信号转导分子参与信号放大，调节细胞周期G1期[16-17]。另外，衰老细胞高度抵抗不同基因毒性损伤诱导的凋亡[18]，其中的效应因子包括Bcl-2、p53、HSP90等[19]。

此外，衰老细胞代谢活跃，分泌趋化因子、促炎细胞因子等成分组成的衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)，维持和传播衰老状态[20]。细胞衰老后溶酶体含量增加，其内的衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)活性相应增强，此项特征是目前细胞衰老鉴定的金标准[21]。

另有学者认为异染色质广泛空间重排，胞核形成衰老相关异染色质结构(senescence-associated heterochromatic foci，SAHF)亦是特征之一[22]。但近年研究发现，异染色质的解体会导致WRN缺陷的MSCs早衰，来自老年个体的原代牙髓MSCs的异染色质标记减少，说明SAHF和MSCs衰老并不总相耦合[23]。

2 延缓间充质干细胞衰老的小分子化合物

小分子化合物是天然提取或人工合成的分子量小于1 000 ku的有机化合物，使用广泛、理论相对成熟，成本低廉、操作快捷，容易监测其药代动力学变化。目前已有部分化合物进入临床试验阶段，产生了细胞重编程、外泌体治疗等手段所能达到的疗效，明显改善及预防MSCs衰老，可见其优势显著，是较为可靠的治疗策略。

2.1 天然化合物

2.1.1 西罗莫司 西罗莫司(sirolimus，Siro)最初来源于智利复活节岛土壤中的吸水链霉菌，临床上常用作强效免疫抑制剂。近年来，大量研究证实，Siro是能有效激活细胞自噬的诱导剂[13]，Siro激活衰老骨髓间充质干细胞(bone marrow derived MSCs，BM-MSCs)自噬，通过减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)、p53水平和受损细胞数量，部分恢复衰老细胞生物学功能[13]。此外，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)通路的持续激活在细胞衰老和组织衰老中起着重要作用[24]。而研究表明，在脐带间充质干细胞(umbilical cord derived MSCs，UC-MSCs)衰老模型中，Siro预处理抵御了衰老诱因对p-mTOR及其下游靶基因p70S6K的快速激活，显著降低SA-β-Gal阳性细胞比例，抑制SASP，双链DNA断裂标志物γ-H2AX的表达水平也随之降低，同时维持异染色质稳定状态，防止DNA的进一步损伤，有效抵抗了细胞衰老[25]。

2.1.2 白藜芦醇 白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种食用多酚类植物保健素。除了抗氧化、抗炎、抗癌，近年来发现其在抗衰方面也可发挥独到作用。Res处理衰老小鼠BM-MSCs后，细胞衰老标志物及ROS水平显著降低，通过AMPK/ROS信号通路促进衰老细胞成骨分化[26]。此外，Res是沉默信息调节因子Ⅰ型(silent information regulator type 1，SIRT1)的有效激活剂[27-28]，通过激活SIRT1，有效延缓早期传代MSCs衰老并提升其干性特性[27]，但细胞在传至第10代后，SIRT1表达水平将随传代进程的延续而降低[29]，因此Res对晚期传代细胞发挥与前述完全相反的效用[27]。研究发现，浓度也是决定药物作用的关键因素，低浓度Res提升SIRT1及增殖细胞核抗原水平，促进UC-MSCs活力，抑制衰老，而高浓度时作用翻转，使细胞周期停滞于S期[28]。另外，细胞所处状态也能影响药物的抗衰老效果。Kornienko等发现，高浓度Res保护静止态BM-MSCs免受氧化应激，触发可逆的细胞周期阻滞，且不产生基因毒性效应，但会导致非静止态细胞不可逆的细胞早衰、周期停滞和DNA损伤[30]。

2.1.3 褪黑素 褪黑素(melatonin，Mel)是松果体分泌的一种神经激素肽，能调节机体昼夜节律。近来相关研究发现Mel是一种强大的内源性自由基清除剂，应用于抗衰老领域前景广阔。Mel处理后，体外长期传代的脂肪间充质干细胞(adipose tissue derived MSCs，AD-MSCs)增殖、迁移提升，内源性ROS含量减少，衰老标志物表达下降，细胞干性得以维持[31]。Zhou等发现，BM-MSCs发生氧化应激性早衰后，Mel通过下调p38-MAPK磷酸化，增加SIRT1表达，以剂量依赖方式有效降低p16INK4a水平，并改善其他衰老表型，提升衰老细胞成骨分化[32]。Han等发现，Mel能以PrPC依赖性方式维护线粒体Ⅰ、Ⅳ复合体的活性，增加线粒体重塑及氧化磷酸化，以抵御氧化应激诱导下慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)鼠来源MSCs的衰老，促进细胞增殖及粘附。而后将已处理的细胞植回体内，发现即使在缺血部位，细胞仍能存活并促进血管新生[33]。此外，Mel还可通过减轻内质网应激、抑制SASP[34]，增强过氧化氢酶活性、调节异常自噬[35]来延缓衰老。

2.1.4 姜黄素 姜黄素(curcumin, Cur)是一种从姜黄属植物中提取的二酮类化合物，能够清除ROS，抑制胞内诱导性氧化应激，并且是有效的炎症调节剂[36-37]。大鼠AD-MSCs经Cur处理后，倍增时长缩短，细胞中SA-β-GAL染色阳性者比例显著减少，而TERT表达明显增加[36]。Rocío等发现，Cur能够作为NF-κB信号通路中p65蛋白的抑制剂，在下调炎性UC-MSCs衰老模型p65水平的同时，导致SASP失活，抑制衰老表型[37]。

2.1.5 其他潜在天然化合物 川芎嗪(tetramethylpyrazine，Tmp),是从川芎中提取的生物活性成分，在衰老小鼠骨髓中局部给药后，可清除衰老BM-MSCs，显著改善衰老表型及代谢微环境[38]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶茶多酚的主要组成成分，在预处理MSCs后，通过激活核因子-红系2-相关因子2防止氧化应激诱导的细胞衰老[39]。槲皮素(quercetin，Que)对采集自Werner综合征、Hutchinson-Gilford综合征、生理性衰老模型的MSCs均表现出衰老表型的延缓作用，并能延长端粒长度，恢复异染色质构架[40]。

2.2 合成化合物

2.2.1 二甲双胍 二甲双胍(metformin，Met)是治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物，除此之外还具有多效性，是近年“老药新用”的代表。研究发现，Met预处理人牙周膜细胞24 h，便能以剂量依赖方式降低氧化应激诱导的胞内ROS积聚，逆转细胞衰老效应，保护细胞成骨潜能，并且，该过程可能与细胞自噬相关[41]。此外，Kim等发现，Met降低衰老相关标志物SA-β-GAL、p16INK4α的表达，以AMPK依赖性方式抑制SASP水平的升高，靶向减轻CKD-MSCs的衰老程度，恢复细胞增殖能力，减少DNA氧化损伤[42]。

2.2.2 Senolytics Senolytics尚无统一中文名称，国内有研究者将其译为“衰老细胞清除剂”[43]，它并非一个特定化合物，而是一类化合物或组合用药的统称。一项有关糖尿病慢性肾病治疗的临床研究证实，作为第一批被研发出的Senolytics，达沙替尼+槲皮素(dasatinib+quercetin，D+Q)组合用药能减少循环中的关键SASP因子，特异性清除高表达p16INK4a和p21CIP1的衰老细胞，降低胞内SA-β-GAL活性[44]。此外，Zhu等发现，D+Q组合用药可显著清除小鼠体内衰老的BM-MSCs[45]。另有大量研究佐证，多种Senolytics可用于清除衰老MSCs。例如，细胞凋亡通路重要调节因子Bcl-2蛋白家族的抑制剂ABT-263可以去除复制衰老的MSCs，但对端粒长度无明显影响[46]。HSP90抑制剂17-DMAG作为一种新型的Senolytics，可以极大降低早衰鼠模型的衰老BM-MSCs百分比[47]。应注意到的是，Senolytics作用方式与其他小分子化合物不同，其一，其靶点为衰老细胞本身，而非特定的单一分子如受体或调节酶，也不是单一的生化途径如信号通路；其二，其作用是降低整体的衰老细胞负担，而非针对单个器官或结构[44]。然而，在肿瘤抑制、胚胎发育等生理性过程中，细胞衰老反而发挥了对机体的保护作用。因此，在未来临床应用中，应慎重考虑Senolytics治疗的时机、部位，并尝试通过多种化合物修饰手段，增加其对目标组织靶细胞的专一性[43]。

3 结 语

上述热点小分子化合物，不论自天然生物提取还是人工合成，均能显著对抗MSCs衰老，并且归根到底是通过削减衰老诱因或改善干细胞所处微环境发挥作用的。然而，目前尚不清楚它们在体内的应用是否会造成长远的不良影响。因此，为了提升MSCs在口腔组织再生中的应用与治疗效率，研究还需要利用更多的生物模型，观察衰老细胞的发生发展规律及用药治疗后的细胞生物学变化，进一步探索个性化用药方案或基于生物材料的治疗方法，例如使用多种化合物联合治疗或改良输送方法，将可能的不良反应作用降至最低，在保证用药安全的前提下转化于临床，产生最有效、最优化的干细胞治疗预后。