肌萎缩侧索硬化病人CCL2和IL-6的表达水平与认知功能的相关性研究

杨国娟，崔 韬

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一类累及上、下运动神经元的神经退行性疾病，病理特征是脊髓、脑干和运动皮层运动神经元的丢失[1]。迄今为止ALS发生机制尚不清楚，越来越多的证据表明神经系统炎症在ALS发病中起重要作用[2]。文献[3]显示，ALS中的神经系统炎症特征在于淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，小胶质细胞和反应性星形胶质细胞的活化以及补体的参与。趋化因子可由小胶质细胞、神经元、活化的星形胶质细胞和单核巨噬细胞等产生，在免疫细胞的募集和激活上起着重要的调控作用[4]。趋化因子配体2(chemokine ligand-2，CCL2)，能够趋化多种免疫细胞到达组织损伤或感染的部位参与炎症反应。CCL2引起Tau蛋白的聚集，引起神经系统炎症加重阿尔茨海默病人的认知功能障碍[5]。本研究收集32例ALS病人和20例肌肉病病人的血浆，ELISA法分析CCL2和白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)水平,利用简易智能量表(mini-mental state examination，MMSE)和及韦氏记忆量表(Wechsler intelligence scale，WMS)评估病人的认知功能情况，明确CCL2和IL-6水平变化对ALS病人认知功能的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年5月至2019年10月首都医科大学附属北京天坛医院收治的ALS病人(观察组)32例和同期入院肌肉病病人(对照组)20例。观察组入选标准：符合1998年ALS 诊断标准的ALS病人，年龄18～80岁。临床表现为：Classic-ALS，在上肢或下肢出现特征性症状或体征，锥体束征明确，但并不突出。UMND-ALS，临床以肢体僵硬、痉挛为主要表现，锥体束征明显，肌肉萎缩及束颤相对较轻，肌电图 CMAP波幅无明显下降。FAS/FLS，临床症状局限于上肢(FAS)或下肢(FLS)持续12个月以上，以肌肉无力伴萎缩等下运动神经元受累体征为主要表现。排除标准：(1)合并其他神经退行性疾病(阿尔兹海默症、帕金森病、多系统萎缩等)；(2)合并肌肉病；(3)合并其他周围神经病(格林巴利综合征、慢性炎症性脱鞘性多神经根神经病、遗传性周围神经病、糖尿病性周围神经病、继发于自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮的周围神经病)；(4)合并肿瘤及自身免疫性疾病；(5)近1个月感染或其他应激事件；(6)严重心脏、肝肾疾病；(7)气管切开或无创机械通气。对照组：选择就诊于我院无神经系统症状及体征者20例，年龄18～80岁，临床确诊为肌肉病、周围神经病(如慢性格林巴利综合征)、其他神经系统疾病(如痉挛性截瘫)。本研究已通过医院伦理委员会审核批准并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法检测血浆CCL2和IL-6水平 CCL2和IL-6的ELISA检测试剂盒购自南京卡米洛生物工程有限公司。血浆5×103r/min离心10 min后，取上清液按10微升/孔加入ELISA板，按照试剂盒操作说明进行检测，450 nm波长处检测各孔的OD值。按照标准曲线计算血浆CCL2和IL-6的浓度。

1.2.2 认知功能评价 由神经内科专科医师对入组的ALS和肌肉病病人进行病史采集以及有关量表的评估。MMSE量表包括：时间定向力、地点定向力、即刻记忆、注意力及计算力、延迟记忆、语言和视空间等7方面内容，总分为30分。WMS检查采用龚耀先修订的量表，包括7个分测验，个人经历、时间和空间的定向、数字顺序关系、逻辑记忆、顺背和倒背数字、视觉再生、视觉再认，图片会议、触摸测验及联想学习等内容，主要记录受试者长时、短时、瞬时记忆测验量表评分。以上量表均在病情稳定且配合情况下一次完成，测验时间为60～90 min。

1.3 统计学方法 采用t(或t′)检验、χ2检验、非参数Mann-Whitney秩和检验和Pearson相关分析。

2 结果

2.1 2组病人一般资料比较 2组年龄、性别和教育程度差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 2组病人一般资料比较

2.2 2组血清CCL2和IL-6水平比较 观察组CCL2和IL-6水平分别为(29.55±2.65)pg/mL和(9.59±0.87)pg/mL，对照组分别为(14.5±0.49) pg/mL和(3.86±0.43)pg/mL，观察组CCL2和IL-6水平均明显高于对照组(t=4.44,P<0.01；t=4.98,P<0.01)。

2.3 2组认知功能评分比较 观察组病人MMSE评分和WMS评分均高于对照组(P<0.05～P<0.01)，观察组记忆优于对照组(Zc=-2.64，P<0.01)(见表2)。

表2 2组病人MMSE和WMS评分比较分)

2.4 血清CCL2和IL-6水平与认知功能的相关性分析 观察组血清CCL2和IL-6与认知功能相关性分析显示，CCL2水平与MMSE评分和WMS评分呈负相关关系(P<0.05)，而IL-6水平与MMSE评分和WMS评分无明显相关关系(P>0.05)。对照组CCL2和IL-6与认知功能评分均无明显相关关系(P>0.05)(见表3)。

表3 血浆CCL2和IL-6与认知功能评分的相关性分析

3 讨论

ALS是一种与运动系统有关的神经退行性疾病，发病高峰期为58～63岁，临床上多表现为疲劳和运动能力下降，呼吸衰竭是病人的主要死亡原因[6-7]。在过去的二十年中，已经认识到15%～20%的ALS病人具有进行性认知异常，最终发展为额颞叶痴呆[8]。由于神经胶质源性炎症在ALS中的作用尚不明确，本研究试图研究小胶质细胞激活为代表的神经炎症与认知障碍的关系，为调节小胶质细胞激活并减缓ALS和其他神经退行性疾病进展为新治疗靶点提供理论基础。

胶质细胞是中枢神经系统实质中唯一的固有免疫细胞，也是细胞因子和趋化因子的主要来源，在发育和内环境稳态中起着重要作用[9]。小胶质细胞的活化，亦称为小胶质细胞增生，伴随着多种促炎细胞因子(TNF、IL-1β等)和趋化因子的合成和分泌、超氧阴离子产生以及受损组织的吞噬清除[10]。ALS中小胶质细胞起着双重作用：(1)神经保护作用，在早期阶段通过吞噬清除死亡神经元和聚集蛋白减轻损伤，同时分泌抗炎和神经营养因子；(2)神经毒性作用，后期激活星形胶质细胞，星形胶质细胞激活导致一个正反馈回路，在该回路中两种细胞类型的稳态功能均失效，诱发以TNF、IL-1β、IL-6等细胞因子和氧化损伤为主的过度炎症，并引起序贯性神经损伤[11-12]。

本研究发现在ALS病人外周血中CCL2和IL-6水平较肌肉病病人明显升高，提示在ALS病人中枢神经系统有小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，分泌过量CCL2和IL-6，进而导致神经系统炎症。这一结果也符合我们对ALS病人颅内存在胶质细胞激活的认知[13]。国外也有学者认为IL-6只在疾病早期显著升高，促进炎症发生进而加速ALS病程的进展[14]。本研究可能受到样本量的限制，未发现观察组IL-6的水平与年龄有关。

本研究利用MMSE评分和WMS评分评估了32例ALS病人的认知情况，发现ALS病人的MMSE评分较对照组明显减低，15.7%的病人存在记忆障碍，并且21.9%的病人处于边界状态。这提示随着年龄的增加和疾病进展，会有更多的病人发生记忆障碍。考虑到本研究中MMSE中记忆和回忆项目的正确回答率明显低于对照组，表明ALS优先损害了语言记忆。有学者通过MMSE评分确定ALS病人存在延迟记忆问题[15]。本研究利用WMS量表也发现ALS病人记忆商评分明显低于对照组。相关性分析显示，CCL2与 MMSE评分和WMS评分均呈负相关关系，提示神经炎症是造成认知功能障碍的原因之一。

ALS病人尚无效治疗手段，目前主要治疗目的是最大程度地降低发病率并提高生活质量[16]。认知功能障碍的发生率及对预后的影响日益受到神经内科医师的认可。本研究明确在ALS病人存在认知功能障碍和小胶质细胞激活，鉴于当前尚无证据指导对ALS认知或其他神经功能缺损的治疗，建立以神经炎症为基础的策略来管理此类症状应成为未来的研究目标。