基于氮掺杂荧光碳量子点的食品金属铜污染均相快速检测

林晓雅，邓锐杰，李海涛，杨淏，刘俊

（1.四川大学轻工科学与工程学院，四川成都 610065）（2.天津市理化分析中心有限公司，天津 300051）（3.成都海关技术中心，四川成都 610041）

目前，水体与土壤的重金属污染情况十分严峻[1]，由于农药、化肥滥用以及垃圾排放，我国农田重金属污染率超过50%[2,3]，此外，江河湖库底质的重金属污染程度突破80%[4]，其中，重金属铜污染显著，排放量约为3.4×106t/年[2]。水体与土壤中的铜可通过工厂加工等方式转移富集于食品中，从而造成食品的重金属铜污染。美国环境保护署（EPA）将自来水中的铜离子含量限制设置为 20 μmol/L[5]，世界卫生组织（WHO）设置饮用水中铜离子含量限制为 30 μmol/L[6,7]，而我国也有相关铜含量限制，如限制饮用水中铜离子的最高浓度为15.6 μmol/L[8]，葡萄酒中铜离子含量为 1.0 mg/L[9]。传统的铜离子（Cu2+）检测方法包括原子吸收光谱法（AAS）[10]、原子发射光谱法（AES）[11]、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[12]、分光光度法[13]和伏安测量法[14]等，这些检测方法具有灵敏度高和选择性好的优点，但是普遍存在操作复杂、样品前处理繁琐、耗时长和检测成本高等缺点。近年来，聚苯胺光谱法[15]和荧光探针法[16]等新型检测方法被应用于铜离子检测中，这些方法耗时短、成本较低，但大多仍存在前处理复杂和检测环境要求高的特点。因此，建立一种检测时间短、条件要求低和成本低的铜离子检测手段是十分重要的。

碳点（Carbon dots，CDs）是指粒径一般小于10 nm的新型荧光碳纳米材料[17]，是荧光染料、量子点和细胞内传感的替代品，具有优异的生物相容性[18]、良好的光稳定性[19]和生物低毒性[20]等优点。碳点的应用广泛，包括重金属检测[21,22]、分子荧光分析[23,24]、细胞标定[25]与药物传递[26]。

本文合成荧光碳量子点并将其应用于食品中铜污染的均相快速检测。主要探究碳量子点对Cu2+的响应动力学，优化了碳量子点的浓度，验证碳量子点检测Cu2+的选择性及定量的线性关系，从而，建立了一种Cu2+的均相快速检测方法。该方法可以在一个离心管内、在室温环境下对Cu2+实现高灵敏检测，检测动态范围是 5～50 μmol/L，检出限为 5.48 μmol/L。该碳量子点有望应用于食品Cu2+污染的现场检测，作为食品Cu2+污染的防控工具。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Synergy H1荧光多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；JEM-2100透射电子显微镜，日本电子公司；UV-1800BPC紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

L-色氨酸、海藻酸钠，上海麦克林生化科技有限公司；氯化铜，四川科伦药业股份有限公司；MES buffer，北京百奥莱博科技有限公司；甲苯，泉州爱德利贸易有限公司。实验用水为分子生物级水，美国纽约康宁。

1.2 实验方法

1.2.1 碳点的制备

2.0 g海藻酸钠粉末与1.0 g色氨酸粉末混合均匀后移入至高压釜中，于220 ℃下持续反应6 h，得到的棕色混合物，然后加入乙醇进行溶解，并于 10000 r/min下离心10 min，收集棕黄色上清液。将收集的液体与甲苯混合[乙醇:甲苯（V/V）=1:3]，于12000 r/min下离心30 min，将离心后的沉淀物置于60 ℃下进行干燥，最后得到棕色粉末即为所需要的碳点[27]。

1.2.2 荧光量子产率测定

碳点的荧光量子产率测定以溶于0.1 mol/L硫酸的硫酸奎宁作为参比物质，室温下测定。先测量碳点和硫酸奎宁溶液在碳点最佳激发波长条件下的积分荧光强度和该激发波长下的吸光度，然后按照以下公式计算碳点的荧光量子产率[28-30]。

式中：

YU——待测未知样品的荧光量子产率；

YS——标准物质的荧光量子产率；

FU——待测样的积分荧光强度；

FS——标准物稀溶液的积分荧光强度；

AU——待测样在同一激发波长下的最大吸光度值；

AS——标准物稀溶液在同一激发波长下的最大吸光度值。

1.2.3 靶标Cu2+的检测

在离心管各加入0.1 mol/L MES buffer、20 μg/mL CDs溶液、再分别加入一系列浓度的Cu2+溶液（50、30、20、10、5 μmol/L），震荡反应后，加入384微孔板中，然后立即放入多功能微孔板检测仪中测定荧光强度，设置激发波长为360 nm，发射波长为420～600 nm。

1.2.4 实时荧光测定

探究了时间参数对检测效果与荧光强度变化的影响。将所有的试剂加入384微孔板中，然后立即放入多功能微孔板检测仪中实时测定荧光强度，检测时间为 0～60 min。

1.2.5 选择性测试

为了验证实验所制备CDs的特异性，选择了Na+、K+、Ag+、Ca2+、Mn2+和 Mg2+作为干扰物与 Cu2+进行比较。首先在离心管中加入500 μmol/L的金属离子、0.1 mol/L MES buffer、20 μg/mL CDs溶液，震荡反应，再将混合液体加入到384微孔板中立即用多功能微孔板检测仪测定荧光强度。

1.2.6 样品测定

（1）样品处理：用自来水配制一系列浓度梯度的Cu2+溶液（10、30、50 μmol/L）。

（2）实际样品荧光测定：3 μL样品溶液、15 μL MES buffer（0.1 mol/L）、3 μL CDs溶液（20 μg/mL）加入离心管中反应，将混合溶液注入到384孔板中，用多功能微孔板检测仪对其进行荧光检测，记录在420 nm处的荧光值，根据实验所得标准曲线方程式计算出Cu2+的浓度。

1.2.7 数据分析

本方法所有试验均重复测定3次，采用OriginPro 8.5软件进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 碳点的表征及Cu2+的检测原理

由于内滤光效应（IFE）[31]和静态淬火效应（SQE）的协同作用，Cu2+可以对CDs荧光团的激发光进行重新吸收，同时，CDs上的氨基可以捕获Cu2+，并形成特定的复合物，然后通过非辐射电子转移过程导致CDs的强荧光淬灭，从而显著抑制CDs的荧光信号。如图1a，20 μg/mL的CDs溶液于激发条件下具有高荧光信号，在加入1 mmol/L的Cu2+溶液后，在同一激发条件下荧光信号被猝灭。因此，可通过测定反应溶液荧光强度的差异可用来定量Cu2+。

利用扫描透射电镜（TEM）对合成的CDs的形态进行了表征。如图1b，合成的碳量子点几乎是均匀分布的，尺寸大约为9～18 nm。

荧光量子产率表示物质发射荧光的总能量与吸收能量之比[32]，采用相对法进行计算，选择硫酸奎宁作为标准物质，通过对标准物和碳点样品进行吸光度和荧光的测量与换算，进而得到样品的相对荧光量子产率[33,34]。硫酸奎宁在0.1 mol/L H2SO4中的荧光量子产率为54%[35]，测得同浓度CDs溶液与硫酸奎宁溶液的吸光度分别为0.09、0.23。荧光强度（图1c），可得积分荧光分别为1612308、6939197，代入1.2.2中的公式计算可得碳点的荧光量子产率为33.27%。

2.2 检测条件优化

该检测方法只涉及一个响应纳米材料，因此仅需要优化CDs的浓度。选择了浓度为0.5、1、5、10、20和30 μg/mL的CDs进行荧光分析，实验结果如图2a显示，随着碳点浓度的增长，荧光强度越强，而当CDs浓度为20 μg/mL时，背景与信号的比值（噪信比）最大，故而后续实验CDs的浓度一律选用20 μg/mL。

研究了铜离子淬灭CDs荧光的实时响应（图2b）。Cu2+的加入会导致CDs的荧光值迅速降低，因此，CDs可以实现对Cu2+的快速响应。基于CDs的荧光传感方法与荧光探针法[36-38]同样具有优异的时效性，可以实现快速的Cu2+检测。

2.3 Cu2+的定量检测

表1 不同Cu2+检测方法的比较Table 1 Comparison of different detection methods for Cu2+

为确保所制备的碳量子点可以用于 Cu2+定量检测，研究了碳点对不同浓度的 Cu2+的响应情况，荧光信号变化如图3所示，荧光值随着Cu2+浓度的增加而逐渐降低，且Cu2+在0.70～1.70 lg μmol/L范围内呈良好的线性关系（图 3），计算出检测限为 5.48 μmol/L（Y=-26744X+58501；R2=0.9956）。美国环境保护署（EPA）将自来水中的 Cu2+的水平限制在 20 μmol/L[5]，世界卫生组织（WHO）将饮用水中 Cu2+水平管制为30 μmol/L[6,7]，国标限定饮用水中铜离子的最高浓度为15.6 μmol/L[8]。本方法的检出限（LOD）符合美国环境保护署、世界卫生组织对用于自来水及中国对用于饮用水中的 Cu2+的限量要求，同时，与比色法相比（表1），具有更低检测限。这些结果表明，该CDs有望作为一种Cu2+的快速现场检测的有效工具。

2.4 选择性

为了研究该检测方法的选择特异性，选择了六种其他金属离子进行验证，结果如图4所示，在相同条件下，Cu2+引起的荧光信号明显高于Ag+、Ca2+、Mn2+、Na+、K+和Mg2+引起的信号变化。可见，CDs对Cu2+具有较强的固有特异性，故只有Cu2+才能诱导出显著的荧光信号，而 Ag+、Ca2+、Mn2+、Na+、K+和Mg2+只引起微弱的荧光信号变化。因此，该方法对Cu2+的检测具有良好的选择特异性，表明其在复杂样品分析中的应用具有潜在的可能性。

2.5 水样分析

表2 自来水中Cu2+加标回收检测结果Table 2 detection of Cu2+ in tap water

为了进一步验证所制备的 CDs在检测实际样本中的可行性，对自来水进行了Cu2+的加标回收实验，使用本实验方法测定三种不同浓 Cu2+（50、30、10 μmol/L）的回收率（表2），回收率在102.40%～ 107.62%之间，验证了该方法可应用在水质中Cu2+的定量检测。

3 结论

利用海藻酸钠作为碳源、色氨酸为氮源，制备了高荧光效应的氮掺杂碳量子点，该碳量子点具有优异的水溶解度和生物相容性，测得其荧光量子产率为33.27%，同时，与其他修饰荧光探针的Cu2+检测方法相比，该方法具有超短的检测时间、较低的灵敏性（5.48 μmol/L）和较高的选择特异性等优势，同时也降低了检测成本和方法的复杂性。该方法将 Cu2+、MES buffer、CDs溶液在室温下简单混合即可实现Cu2+的即时检测。此外，该方法能够准确检测出实际食品样品中Cu2+的含量，并已成功应用于水样中Cu2+的检测，因此，为检测水体、农田等环境以及农作物、葡萄酒等食品中的Cu2+增加可能性，有望为食品安全领域重金属的检测控制提供新的工具，在食品安全领域具有潜在的应用价值，同时，具有高时效性、高准确性、高稳定性、低成本、低检测要求的特点，符合当前食品重金属安全监管的需求。