金银花对铜绿假单胞菌生物膜及QS系统作用研究进展①

(1.桂林医学院，广西 桂林 541199；2.湖南中医药大学临床医学院，湖南 长沙 410007)

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，PA)是一种常见的机会致病菌，是引起免疫力低下患者细菌感染的常见病原体，由于抗菌药物的临床广泛使用，耐药株不断增加，导致PA感染易反复发作，且难以控制。PA具有较强的生物膜形成能力，可引起急慢性感染。有研究表明，至少65%的慢性PA感染与生物膜形成有关，而生物膜的形成受群体感应(quorum sensing，QS)系统的调控。QS 系统是一种密度依赖性的基因表达调控系统，当其感知到病原菌生长密度达到阈值水平，通过信号分子与靶受体的结合而启动QS系统。PA感染是一个慢性、复杂化的过程，与其慢性感染密切相关的是PA可以分泌绿脓素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂等多种毒力因子。这些毒力因子的分泌是由群体感应系统参与调控的[1-2]。

近年来，细菌耐药成为临床棘手的难题，而中药作为细菌耐药的新型抑制剂受到广泛关注。中药安全性高，又具有与抗生素不同的抗菌机制，有不易产生耐药性等优点。金银花，为忍冬属植物，其干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、抑菌消炎等功效，广泛用于医药及日用品中。目前，已有多种金银花和(或)山银花制剂用于治疗PA感染所致的呼吸系统疾病。而“中药抗生素”分子水平的基础研究很少，作用的靶点模糊，对抗细菌耐药性的机制阐述仍不清晰，不能深入揭示中药抗细菌耐药性的机理和作用，严重制约了“中药抗生素”的突破和发展。本文从金银花对PA的群体感应系统作用机制进行综述。

1 PA生物膜与耐药

“生物膜(biofilm，BF)”也称为微生物群落，是指细菌附着于黏膜或生物医学材料表面，通过分泌ECMs(细胞外基质)如：胞外多糖(EPS)、胞外DNA(eDNA)、RNA、蛋白质和脂类等将其自身包绕其中而形成高度致密的膜样聚合物[3]。生物膜相当于细菌的“保护膜”，所以生物膜菌对各种消毒剂和抗生素的抵抗力通常比浮游菌更强[4]。生物膜的形成，提高了细菌对抗生素和宿主免疫反应的抗性，故生物膜已成为医学领域的一个研究热点。

PA的耐药机制十分复杂，几乎具有细菌所有的耐药机制，形成生物膜是PA耐药的重要原因之一[5]。PA生物膜的形成主要包括以下几个阶段。①附着：PA的初始附着由黏附素、IV型菌毛和脂多糖介导，并受c-di-GMP(环二鸟苷酸)和sRNA(小分子核糖核酸)调控。②成熟：生物膜的成熟主要表现为生物膜结构的形成和ECM的产生。③剥离：包括剥落、侵蚀和播撒3个阶段，剥落和侵蚀为被动剥离，播撒扩散为主动剥离[6]。

2 PA 的群体感应系统

PA生物膜的发育受多种因素的影响，QS系统是调控PA生物膜形成的主要机制之一。1998年戴维斯和他的同事首次报告了QS系统在生物膜形成中的作用[7]。在PA中至少存在4种QS系统，即las系统、rhl系统、喹诺酮信号系统以及近期发现的IQS系统[8]。其中前两种是由酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones，AHLs)信号分子介导，占主导地位，控制毒力因子的产生和生物膜的成熟。喹诺酮系统是由喹诺酮类信号分子介导的，受las系统调控却又能调控rhl系统，是前两个系统之间的桥梁。IQS系统是近年新发现的QS系统子系统，可以参与rhl系统及喹诺酮系统信号分子的合成[1]。

las系统主要由lasI和lasR两个编码基因介导，其中lasI合成酶合成AHLs的同系物3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(3-oxo-C12-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL)；lasR编码生成转录因子LasR。当3-oxo-C12-HSL分子在细胞环境中达到假定的阈值时，其作为诱导PA群体感应的重要分子，通过与LasR的相互作用产生多聚体，从而启动las系统。该系统参与调节急性感染的多种毒力因子的表达，包括外毒素A、LasA、LasB弹性蛋白酶和蛋白水解酶等。rhl是PA的第2个系统。与las系统一样，rhl系统同样是由rhlR和rhlI两个基因调节，其中rhlR编码生成RhlR；rhlI编码生成丁基高丝氨酸内酯(N-butyryl-homoserine lactone，C4-HSL)，RhlR和C4-HSL结合后主要负责调控鼠李糖脂的表达，以及参与PA毒力因子释放到宿主细胞胞质中的调控；并且rhl系统在转录和转录后的水平上也受到las系统的分级调节。喹诺酮系统是PA的另一个QS系统[9]，其中pqsABCDE编码生成PqsE和 2-庚基-4-喹诺酮(2-heptyl-4-quinoline，HHQ)。PqsH是一种由las系统调控的基因，在转换HHQ到喹诺酮系统信号分子2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinoline，PQS)的过程中承担重要角色。喹诺酮系统主要负责诱导鼠李糖脂和其他参与PA生物膜形成的分子产生。后来发现的一个QS系统是IQS，IQS系统的信号分子为2-(2-羟基苯基)-噻唑-4-碳醛(IQS)，IQS由非核糖体肽合成酶基因簇ambBCDE编码产生[1]；它可以将环境压力因素整合到QS中。IQS系统既参与调控PQS，又可以调节C4-HSL以及相关毒力因子的产生，如弹性蛋白酶、鼠李糖脂等。

实践证明，这4套QS系统是分层次调节的，如图1。研究证实[10]， las系统在QS系统中具有最高的地位，可以对rhl、PQS和IQS系统进行分级调控。另外，las 系统信号分子3-oxo-C12-HSL 可功能性地结合于RhlR蛋白调节器，促进其裂解及失活；rhl系统还可以调控绿脓菌素的产生，导致真核宿主细胞发生氧化性损伤，破坏宿主抗氧化防御系统；rhl系统处于最低水平，受其他所有QS系统的调控，并能激活许多与QS相关的毒力因子；且RhlR对PQS有负调节作用。相关研究表明在细菌生长稳定期，RhlR 可替代缺失的 LasR，促进蛋白酶、绿脓菌素、PQS及3-oxo-C12-HSL的产生。PQS由las和IQS激活，并激活rhl系统。IQS由las激活，并参与调控PQS和rhl系统，可正调控PQS和C4-HSL产生[11]；当然，每个QS系统也可以被环境因素以及一些宿主源性因素激活。

图1 铜绿假单胞菌的QS系统

3 金银花与PA的生物膜和QS系统

3.1 金银花的抑菌作用

临床上抗菌药物广泛应用及不合理使用导致细菌耐药性逐渐增加，中草药抗菌作用的研究成为热点。金银花是常用的中药品种，《药典》分列收载金银花与山银花，山银花和金银花药性相同，组分相似，主要为绿原酸及黄酮类等。金银花具有广谱抑菌作用，且耐药性发生率低等特点，系列研究证明金银花及组份对PA及其耐药菌均有抑制作用[12-14]。

3.2 金银花与PA的生物膜

细菌生物膜是指细菌黏附于接触表面，被自身分泌的胞外聚合物包裹形成的细菌聚集的膜状结构。生物膜多细胞结构的形成是一个动态过程， 包括细菌起始附、生物膜发展和成熟等阶段。金银花可通过抑制细胞生物膜形成过程中发挥其抑菌作用，形成生物膜是PA耐药的重要原因之一。

陈一强等[15]通过体外复制PA的生物膜模型发现金银花组PA在固体表面的黏附数明显少于空白对照组，62.5 mg/ml的金银花可以抑制和破坏早期及成熟生物膜，证实金银花水煎液在体外能抑制PA对固体表面的粘附能力及生物膜形成能力，并能破坏PA已形成的生物膜，增强CAZ(头孢他啶)对生物膜内PA的清除作用。温红侠等[16]研究金银花主要成分绿原酸的抑菌作用机制，通过构建体外PAO1生物模型，并测定MIC值，电镜观察载体表面生物膜形态，空白对照组见大量分布均匀的微菌落和游离细菌，而建模3 d、7 d绿原酸组分别偶见聚集菌落、仅见稀少的薄层生物膜，表明绿原酸可以抑制PA的生物膜形成， 并对早期和成熟生物膜具有破坏作用， 对于生物膜内PA与CAZ有协同杀菌作用， 并且强于红霉素组。袁秀丽等[17]通过试管稀释法测定金银花水煎液和庆大霉素对PA的MIC(最小抑菌浓度)，用MTT法建立体外PA生物膜并检定金银花水煎液和庆大霉素不同MIC浓度的抗PA生物膜作用，得出金银花水煎液在体外能抑制PA对固体表面的黏附能力及生物膜形成能力，并能破坏PA已形成的生物膜，增强庆大霉素对生物膜内PA的清除作用。王琳等[18]证明金银花提取物对PA生物膜有清除作用，而且对于生物膜的初始黏附作用效果更强。该研究采用激光共聚焦显微镜观察在金银花提取物作用下的PA 的生物膜的整体发展和结构变化，发现金银花提取物主要通过抑制生物膜立体结构形成而实现对生物膜的清除作用。

3.3 金银花与PA的QS系统

金银花及其组分绿原酸等均被证实对PA的QS系统相关毒力因子，如弹性蛋白酶、绿脓素的表达及QS基因有抑制作用。陈一强等[15]证实了金银花组分绿原酸具有抑制PA毒力因子及QS系统信号分子的作用，这可能与其抑制了QS系统的相关基因表达有关；该研究还通过动物实验进一步证实了绿原酸在体内对PA的抑制作用。李镛等[19]研究发现，泛耐药 PA 群体行为与 QS 基因相关，且弹性蛋白酶和LasI，LasR表达过高，提示 QS 基因在 PA 耐药机制中起重要作用。Wang等[20]也证实绿原酸在转录水平对QS系统进行调节，下调PA的QS相关基因lasI，lasR，rhlI，rhlR，pqsA和pqsR的表达，从而细菌生物膜形成受阻，成群运动减弱和毒力因子表达下降。Annapoorani等[21]采用Glide version 5.5筛选1 920种天然化合物和PA的LasR和RhlR受体蛋白进行对接、QSI评价。绿原酸在总蛋白水解试验、LasB弹性蛋白酶试验、溶血素测定试验对PA01， AS1 and AS2 菌株均表现出不同的抑制效果，蛋白酶显示出活性下降，即这五种QSI化合物可能抑制蛋白酶的产生，并且这五种化合物并未与蛋白酶进行结合或者降解酶活性，说明是通过化合物本身的QSI潜力起作用。在PA01、AS1和AS2生长中，被测QSI化合物作用组和对照组的细胞生长密度无变化，也证明了这些化合物的抑制作用不是由于抗菌活性，而可能是通过QSI活性。本课题组前期研究发现亚抑菌浓度(4 mg/ml)的山银花粗提物对绿脓素及弹性蛋白酶的表达有显著的抑制作用，山银花粗提物在MIC时对鼠李糖脂有极显著抑制作用；实时荧光定量PCR检测结果显示山银花粗提物在亚抑菌浓度(4 mg/ml)时，rhlI和lasI基因的表达量显著低于空白对照组；在MIC时对rhlR基因的表达有显著的抑制作用。

综上所述，形成生物被膜是PA耐药的重要原因之一，而QS系统是调控PA生物膜形成的主要机制之一。金银花能抑制PA的QS相关毒力因子及基因的表达，破坏其生物膜的形成，达到一定抑菌的效果。我国中草药文化历史悠久，中草药抑菌作用研究成为国内研究热点，金银花在治疗感染性疾病方面具有多成分、多作用、多途径、多环节的特点，抑菌机制值得深入研究。