小四五颗粒调节狼疮肾炎小鼠的免疫功能及机制①

曹 慧②，王福东③，孙乐栋2，刘 佳，李宗香

(1.桂林医学院第二附属医院皮肤科， 广西 桂林 541199；2.南方医科大学第五附属医院皮肤科， 广东 广州 510515)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE)是一种累及多系统、多器官组织的全身性自身免疫性疾病，临床高发于育龄期女性，本病临床表现复杂多样，病情反复难愈，病程迁延，严重危害我国人民健康。其中，狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)是SLE最严重的并发症，并发率高达55%以上，且肾脏受累损害的程度与患者预后密切相关[1]。系统性红斑狼疮是由B细胞介导的慢性自身免疫性疾病，自身抗体的产生以及III型超敏反应的慢性系统性炎症是该疾病的显著特征[2]。自身抗体和相应抗原形成免疫复合物，沉积于各组织、器官，引起局部组织炎症和损害[3]。LN是SLE所产生的免疫复合物沉积在肾脏，改变肾血管的通透性所引起的一种继发性肾小球疾病。目前，国内外常规的药物治疗根据临床表现的轻重，病理类型的不同，治疗方案不一而足。主要的药物有糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等，但是长期应用大剂量免疫抑制剂，毒性反应大，长期应用糖皮质激素会增加SLE患者慢性器官损害并导致患者生存率下降。中医认为，LN的发生属正虚邪实，肾虚为本，热毒为标[4]，治疗应当以益肾健脾为根基[5-6]。小四五颗粒由东汉张仲景《伤寒论》中的小柴胡汤、五苓散及宋代《太平惠民和济局方》中的四物汤三方组成，本文将探讨该药方对狼疮肾炎的治疗作用及其免疫机制。

1 材料与方法

1.1 材料

8周龄雌性MRL/MpJ-Faslpr小鼠和8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠，购自广州市赛柏诺生物科技有限公司。小四五颗粒剂(柴胡、黄芩、半夏、人参、白术、茯苓、泽泻、猪苓、桂枝、熟地黄、白芍、当归、川穹等)由广东一方制药厂生产，每袋3 g，相当于生药6 g。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 MRL/MpJ-Faslpr自发性狼疮小鼠20只，随机分成两组，狼疮对照组和小四五治疗组，各10只，Balb/c小鼠10只为正常对照组，小四五治疗组予小四五颗粒剂，制成每毫升含生药6 g的水煎剂，根据许淑云主编的《药理学实验方法》，按公式：小鼠剂量(g/kg)=人用剂量×0.0026×50 g计算，小四五给药组给予0.2 ml/20 g的小四五悬液灌胃，2次/d，连续6周，狼疮对照组及正常对照组等体积生理盐水灌胃，2次/d，连续6周。

1.2.2 尿蛋白含量检测 于用药后6周末采集小鼠晨尿，将所有尿液标本稀释500倍，采用碧云天公司生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒检测尿蛋白含量，加入样品及工作液后，37 ℃孵育30 min，酶标仪测定570 nm吸光度值，根据标准品计算样品尿蛋白浓度。

1.2.3 血清IL-4、IL-10、IFN-γ检测 小鼠于第6周末眼眶取血，4℃，4 000 r/min，离心15 min，取上清液冻存于-80 ℃备用，小鼠血清中IL-4、IL-10、IFN-γ检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 流式细胞仪检测Th1与Th2细胞数量 小鼠处死后，分离脾脏100 mg，制备脾脏单细胞悬液，以每孔1×106个细胞接种于24孔细胞培养板中，加入细胞刺激剂及高尔基体抑制剂，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养5 h，固定、破膜、染色后，行流式细胞术，检测脾脏中Th1与 Th2细胞数量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 尿蛋白测定情况

与正常组小鼠相比，狼疮组小鼠尿蛋白含量显著增加；与狼疮组相比，小四五治疗组小鼠尿蛋白含量降低(P<0.05)，见表1。

表1 不同组小鼠尿蛋白检测情况

2.2 血清IL-4、IL-10、IFN-γ含量测定

与对照组小鼠相比，狼疮组小鼠血清中IL-4、IL-10含量显著增加，IFN-γ含量显著降低；与狼疮组相比，治疗组IL-4、IL-10含量降低，增加IFN-γ含量(P<0.05)，见表2。

表2 小四五颗粒对MRL/MpJ-Faslpr小鼠血清IL-4、IL-10、IFN-γ的影响

2.3 Th1细胞与Th2细胞水平测定

流式细胞术检测结果表明，与对照小鼠相比，狼疮组小鼠脾脏中的Th1水平显著降低，Th2细胞水平显著升高(P<0.05)，与狼疮组相比，小四五颗粒能显著增加Th1细胞水平，降低Th2细胞水平，Th1细胞/Th2细胞比值显著升高，见表3。

表3 小四五颗粒对MRL/MpJ-Faslpr小鼠脾脏Th1细胞和Th2细胞数量的影响

3 讨论

系统性红斑狼疮的发生和进展与遗传、免疫、感染、激素和环境因素等有关，患者B淋巴细胞异常增生，T淋巴细胞降低，体内出现大量抗体和致病性循环免疫复合物，激活补体系统，进而引起全身炎症反应和免疫损伤[7]。近年来，机体免疫调节功能系统，尤其是Th1/Th2细胞失衡成为临床研究SLE的热点。 Th1细胞能分泌生成IFN-γ等因子，对细胞免疫具有介导作用，能促进T细胞分化及成熟、增殖，促使炎症介质合成[8]。Th2细胞能分泌生成IL-4、IL-10等因子，对体液免疫具有介导作用，能促进B细胞分化及成熟、增殖，促使IgE、IgG类等抗体生成[9]。Th1细胞、Th2细胞及其分泌的细胞因子的平衡破坏在SLE发病机制中有重要作用。

狼疮肾根据其临床表现， 可归属于祖国医学“水肿”“虚劳”“肾痹”等范畴。中医学认为，LN的发生是由人体先天禀赋不足，阴阳气血失调，加之毒邪侵入，导致毒邪内蕴于肾，血脉凝滞而致[10]。故本病以肝肾亏虚为本，热毒瘀结为标，本虚标实的症状贯穿疾病的始终。小四五颗粒中，小柴胡汤疏通三焦、理气和解；五苓散通阳化气，利水渗湿；四物汤养血活血祛瘀。全方脾肾双补，攻补兼施，阴阳相济，可行气祛瘀，升清降浊，水湿归于正化，使尿蛋白减少，肾功能改善。四物汤为中医补血理气的经典方剂，现代研究发现，它于免疫系统的功能具有多向调节作用，能增强细胞免疫功能[11-12]。

研究结果显示，MRL/MpJ-Faslpr小鼠脾脏Th1细胞/Th2细胞比值降低，与此相一致的是MRL/MpJ-Faslpr小鼠外周血中IFN-γ水平降低，IL-4、IL-10水平升高，经小四五颗粒处理后，可缓解Th1细胞/Th2细胞比例及其分泌的细胞因子不平衡。笔者推测小四五颗粒对狼疮小鼠肾炎病情的改善，可能通过降低Th1细胞/Th2细胞比值，减少自身反应性B细胞及自身抗体的产生进而减少肾脏免疫复合物的沉积，最终减轻肾脏的损害。后续，笔者将深入开展相关机制研究。