结直肠癌患者Kras基因突变与分化程度及组织类型的相关性研究①

，王海鹏 ，朱袭嘉，李盛国，蒋世宇，张琪琦

(桂林医学院第二附属医院胃肠外科，广西 桂林 54199)

结直肠癌，是肠道高发的恶行肿瘤之一，通常侵袭大肠，通常以肠壁息肉开始[1]，是男性第三大常见癌症，女性第二常见癌症。KRAS基因是与人类肿瘤相关的RAS基因家族的成员。因为RAS蛋白编码为21 kD[2]，所以，KRAS也被称为p21基因。目前，已经有多个研究表明，在结直肠癌患者中，KRAS基因的突变率最高[3]，且在女性、中高分化患者中的突变率更高[4-5]。KRAS的第二号外显子突变存在于45%的结直肠癌中，涉及到肿瘤的发生、增殖和进展及预后[6]。 KRAS的其他外显子突变、NRAS等突变也占了10%的比例。 临床研究证实，不论是西妥昔单抗、帕尼单抗，还是厄洛替尼、吉非替尼，都未能让RAS突变的肠癌患者从EGFR靶点的靶向治疗中受益。基于此，本研究分析结直肠癌患者的KRAS基因的突变情况及其潜在突变位点，为结直肠癌患者诊疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月至2020年7月于桂林医学院第二附属医院确诊为结直肠癌患者89例，其中有26 例KRAS突变阳性患者，将其纳入突变组；63 例KRAS突变阴性患者，将其纳入未突变组。

纳入标准：①术后病理学确诊为结直肠癌；②术前检查后 1 周内接受根治性手术治疗，淋巴清扫至肠系膜血管根部，肠系膜下动脉选择根部离断或保留左结肠动脉分支后离断，直肠远切缘距肿瘤至少2 cm；③肿瘤边缘≥5 cm行KRAS基因检测。

排除标准：①有原发性直肠癌外的其他腹盆腔疾病或相关血管相关疾病(如门静脉高压、血管狭窄、血栓或发育变异)；②合并严重糖尿病、高血压、感染者；合并肾、心、肝、肺等脏器功能严重障碍者及患有其他恶性肿瘤患者；③临床资料不完整。

本研究经桂林医学院第二附属医院医学伦理委员会审核批准后执行。

1.2 方法

采用荧光定量PCRTaqman-ARMS探针法测定K-ras基因突变。①总RNA提取：将Trizol裂解组织的混合液收集至灭菌的1.5 ml EP管中，4 ℃、12 000 r/min、离心15 min，吸取上清液至另一灭菌的1.5 ml EP管中，并加入200 μl氯仿，盖紧管盖，剧烈充分震荡15～30 s，至乳化充分，无分相现象。室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min、离心15 min，于上清液中加入500 μl异丙醇，并盖紧管盖，正反颠倒EP管，混匀。室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min、离心15 min。最后，去除EP管，仔细观察管底部是否有微小的白色沉淀，此即总RNA。②用75 %乙醇洗涤RNA，去除上清液，小心沿管壁加入75 %乙醇1 ml/管，轻轻上下翻动EP管，使沉淀从管壁脱落，4 ℃、12 000 r/min、离心5 min，去除上清液，以滤纸吸干管口乙醇，开盖晾干。加入DEPC水30 μl/管，溶解RNA，用紫外分光光度计测定OD260与OD280，并计算OD260与OD280比值，筛选比值在1.8～2.0的样本用于后续实验。RNA浓度计算：RNA浓度(μg/μl)=(OD260×40×稀释倍数)/1 000。③配置RT-PCR反应液及琼脂糖凝胶：首先安装好制胶架和梳子，然后秤取琼脂糖1.5 g，用100 ml电泳缓冲液溶解，微波炉中加热2 min至沸腾，取出后冷却至50 ℃左右，加入缓冲液，调节终浓度为0.5 μg/ml，最后将加入染料的琼脂糖凝胶倾倒入制胶架内，室温凝固20 min，垂直拔掉梳子，将琼脂糖凝胶转移至水平电泳槽内，加入电泳缓冲液，使液面与凝胶面齐平，梳子孔中充满电泳缓冲液。将扩增产物按照5∶1加入6×上样缓冲液，混匀，每孔加入5 μl进行电泳。电泳仪参数设定为80 V、60 min，恒压电泳，电泳过程中随时观察溴酚蓝电泳位置，跑至凝胶边缘立即停止电泳。④测序反应及纯化：向新的0.2 ml的EP管中加测序试液1 μl、酶解产物2 μl和引物2 μl 进行 PCR 扩增，扩增条件为96 ℃、1 min循环 1 次，96 ℃、10 s，50 ℃、5 s，60 ℃、2 min循环 25 次，25 ℃、1 min循环1 次。加醋酸钠-乙醇混合物16 ul(醋酸钠∶乙醇=1∶15)并剧烈震荡，避光静置15 min后4 ℃、12 000 r/min、离心30 min，去除上清液，加预冷70 %乙醇70 μl，剧烈震荡，4 ℃、12 000 r/min、离心15 min后去除上清液。颠倒数次混匀后4 ℃、12 000 r/min、离心5 min后去除上清液。再次加预冷70 %乙醇70 μl，颠倒数次混匀后4 ℃、12 000 r/min、离心5 min后去除上清液，室温放置30 min让酒精挥发干净，加入去离子甲酰胺溶解DNA。⑤PCR仪变性：95 ℃、4 min，4 ℃、4 min。向96孔板内移液，每孔加11 μl，避免孔内出现气泡。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 突变组与未突变组一般资料均一性检验

突变组和未突变组的年龄分别为(57.12±8.40)岁、(58.71±9.02)岁；突变组26例，男12例，女14例；未突变组63例，男31例，女32例；突变组BMI(23.81±2.09 kg/m2)，未突变组BMI(58.71±9.02 kg/m2)；突变组病变部位：结肠癌18例，直肠癌8例；未突变组病变部位：结肠癌39例，直肠癌24例。比较突变组与未突变组临床一般资料无显著的统计学差异(P>0.05)，资料有较好的可比性，见表1。

表1 一般资料均一性比较

2.2 KRAS基因突变与组织学类型的相关性分析

分析KARS基因突变与组织学类型的关系，发现突变组腺癌比例(80.77%)显著高于未突变组腺癌比例(44.44%)，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。此外，分析肿瘤分化程度和KARS基因突变的关系，发现高分化、中分化和低分化的程度和突变与否有统计学差异(P<0.05)，在突变组中中分化的比例较高，见表3。

表2 两组不同组织学类型结直肠癌组织中KRAS基因突变分析(n，%)

表3 两组不同分化程度结直肠癌组织中KRAS基因突变分析(n，%)

3 讨论

结直肠癌是肠道高发的恶性肿瘤之一，也是继肺癌之后人类最高发的癌症种类[7]，在世界范围以北美洲及大洋洲地区多发，在我国东南沿海地区常见。结直肠癌的发生发展与很多基因相关，如KRAS基因、RAS基因等。各种基因共同或单独作用，影响结直肠癌的进程，如KRAS和PIK3CA双突变与侵袭性临床病理特征显著相关[8]。CRC患者粪便中BRAF V600E突变及KRAS突变与肿瘤的位置、组织病理及分化程度也有显著关系[9]。KRAS蛋白为单聚体G蛋白，其磷酸化可导致PI3K-PDK1-PKB和RAF-MEK-MRK1/2信号通路的激活，一般认为KRAS突变是结直肠癌形成的早期。有研究已证实，β-catenin和Cyclin D1两种蛋白在KRAS突变型结直肠癌样本中的表达水平非常高，且抑制β-catenin表达后KRAS突变型结直肠癌细胞的增殖也降低，这促进了细胞的凋亡[10]。也有研究表明，KRAS基因突变与性别、分化程度有关，NRAS基因突变与分化程度、肿瘤类型有关[4]。而结直肠癌中hMSH2表达缺失对KRAS基因突变也有一定影响[11]。KRAS基因突变不仅可以为诊断结直肠癌提供帮助，也会影响EGFR抑制剂在临床上的作用，用KRAS StripAssay检测结直肠癌患者KRAS突变是一种新型的有效方法[12]。

KRAS基因突变的结直肠癌患者中，约85%～90%的突变集中在第2号外显子的12、13密码子上[13]，其余突变中约5%发生在61密码子上，5%发生在146外显子上[14]。KRAS基因突变与PD-L1表达有相关性[15]。研究表明，有28.7%的CRCs存在密码子12和13的KRAS突变，密码子12上甘氨酸-天门冬氨酸突变(p.G12D)和密码子13上甘氨酸-天门冬氨酸突变(p.G13D)是最常见的突变类型[16]。相关研究结果显示，KRAS基因在结直肠癌中患者的突变率为20%～50%[5]。也有相关文献报告[17]，KRAS基因突变与结直肠癌pTNM分期密切相关。由此可见，KRAS基因突变与结直肠癌密切相关，而KRAS基因突变与很多因素都有直接或间接的关系[18]。

本研究中，通过筛查结直肠癌患者，检测出26例KRAS基因突变，提示KRAS在结直肠癌发生和进展中的重要性。通过选取的临床病例统计发现，肿瘤高、中、低分化程度及pTNM分期与KRAS突变情况有显著统计学差异，也有一些报告与本研究结果类似[9]。然而通过比对发现，KRAS突变组腺癌比例显著高于未突变组，且具有统计学差异。相较于黏液腺癌，腺癌发生KARS基因突变的比例更高，说明KARS基因突变的患者更容易出现腺癌而非黏液腺癌。既往有研究证明，在许多结直肠腺瘤组织中也可以检测到KRAS基因突变，这说明KRAS基因突变先于肿瘤发生之前，这也解释了本研究结果的科学性。此外，本研究结果提示，肿瘤发生前的KRAS基因突变检测，能为癌前患者作出风险评估，起到提前预防的效用。

综上所述，KRAS基因突变与结直肠癌组织学类型和分化程度有一定相关性。本研究后续通过随访结直肠癌患者，对KRAS基因可能突变位点与突变率进行分析，这将有助于开展临床个体化精准治疗，提升患者的预后及生活质量[19]。