中草药提取物对多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌效果研究

李海利，方剑玉，游 一，郎利敏，张立宪，张青娴，朱文豪，焦文强，王治方，徐引弟，许 峰，王克领，冯丽丽

(1.河南省农业科学院，畜牧兽医研究所，郑州 450002；2河南省农业科学院农业经济与信息研究所，郑州 450002)

猪接触传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia, PCP)又称坏死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)引起的一种急性呼吸道传染病，以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为主要特征。急性者病死率高。慢性者常能耐过。其典型病理变化为两侧性肺炎，胸膜粘连，肺炎区色暗质脆[1-3]。猪接触传染性胸膜肺炎是危害养猪产业生产的重大细菌性疾病之一[4-5]。为控制该病的发生和流行，以及发病后的治疗，养殖户首选应用抗生素，由于抗生素的普遍应用，甚至超量使用和滥用，导致多重耐药菌株和超级耐药菌株的出现，给临床治疗和防控带来了挑战[6-9]。前期研究表明，临床分离的胸膜肺炎放线杆菌对多种抗生素表现耐药性，而且耐药率在不断增强，出现交叉耐药胸膜肺炎放线杆菌，使该病的治疗变得愈加困难[10-11]。

由于抗生素、化学药物的超量使用，会在动物产品和代谢物中的残留，产生较为严重的食品安全和公共卫生安全问题，这与我国畜牧业发展导向和供给侧结构改革及向安全、绿色、健康、无抗发展方向相违背。在无抗养殖、动物疫病防控和食品安全的多重压力下，研发和筛选高效、低毒、安全、无抗的兽用抗菌药物越来越迫切。所以从天然药物或中草药中筛选毒副作用小的高效抑菌中草药及其有效成分的复配物刻不容缓。中药是我国的“天然医药宝库”，具有多成分、多途径、多靶点、不易产生耐药性等优点[12-15]。中草药中含有复杂抑菌成分，如多糖、生物碱、氨基酸、酚类、肽类等天然活性成分，中药不但具有广谱抗病毒、抗菌、抗氧化、清除自由基、抗寄生虫、抗肿瘤、促进动物生长、提高机体免疫力、增强抗病力的功效，而且对提高机体的免疫功能有奇效，还具有抗菌谱广、不易产生耐药性、可以联合应用等优点[16-19]。本研究在前期大量研究的基础上，以穿心莲、黄芩、苦参、白头翁、芒果叶和百里香6种中草药对猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株的体外抑菌试验，旨在筛选对多重耐药菌株具有较好抑菌效果的中草药，为动物专用新型抗菌药物研发、无抗养殖和临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药材和菌种 穿心莲、黄芩、苦参、白头翁和百里香购自张仲景大药房，芒果叶采自海南岛芒果树，经过晾晒的干品。多重耐药胸膜肺炎放线杆菌菌株由河南省农业科学院畜牧兽医研究所畜禽传染病研究室提供，6株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌菌株对磺胺类药物、四环素类药物和氨基糖苷类药物耐药[10-11,20-21]。

1.1.2 仪器与试剂 纯水系统(Milli-Q)、生物安全柜(美国Forma全排B2型)、PCR扩增仪(Eppendorf)、凝胶成像仪、真空DNA浓缩仪(Eppendorf, Concentrator 5301)、超净工作台、小型低温高速离心机(Heraeus)、CO2培养箱(美国Forma)、立式高速离心机(美国Beckman)、台式大容量冷冻离心机(德国Eppendorf)、微量离心机(德国Eppendorf)、紫外分光光度计(岛津UV265，RF540)、大型恒温摇床(上海智诚ZHWY-211B)、超声波破碎仪(Vibra Cell, VCX750)、-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo Forma)、荧光显微镜(日本Nikon)、自动酶标光度仪(美国Bio-Rad)、荧光定量PCR仪(美国ABI)、梯度PCR仪(美国Bio-Rad)、核酸电泳系统(美国Bio-Rad)、核酸蛋白定量仪(美国Bio-Rad)、图像扫描分析系统(美国Bio-Rad)、移液抢、打孔器。试验所需试剂蛋白胨、大豆酪蛋白琼脂培养基、大豆酪蛋白培养基、牛肉膏、琼脂粉均为国产分析纯(宝生物工程(大连)有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 药液的煎制 采用水提取和65%乙醇提取相结合的提取方法制备单剂中草药的提取液。称取所需药材的量，将药材放入粉碎机中粉碎，使其成200目。加入8倍量的水浸泡3 h，然后放入提取锅中加热煎煮提取1 h，用纱布过滤，滤渣再用8倍量的65%乙醇提取1 h，用纱布过滤。合并两次提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇和浓缩提取液，浓缩至使药液浓度含原生药材为1 g/mL，放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌种活化剂浓度测定 试验前将低温冻干保存的菌种接种于大豆酪蛋白培养基(含5%的胎牛血清和0.1%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)使其活化，在5%的二氧化碳培养箱中37 ℃培养24 h，用微量移液器吸取100 μL菌液加入500 μL大豆酪蛋白培养基(含5%的胎牛血清和0.1%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)中进行扩培，在5%的二氧化碳培养箱中37 ℃培养24 h，然后用比浊管比浊法进行活菌计数，测定后配制成1×109cfu/mL的菌液。

1.2.3 中药提取液体外抑菌试验 对6种中草药的提取液进行琼脂扩散抑菌试验。在超净工作台内无菌操作，用移液抢吸取50 μL 1×109cfu/mL的菌液均匀涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基表面上，再用直径为6 mm的打孔器在琼脂培养基上等距离打孔，每个平板打四个孔，加入对应的无菌中药提取液100 μL，每个平板用一孔加入0.9%生理盐水作为对照，置二氧化碳培养箱中37 ℃培养24 h，观察有无抑菌圈，并测量其直径。每种中药提取液对多重耐药菌株均做3个平行试验，抑菌圈大小取3次结果的平均值。抑菌效果判定按照如下标准：抑菌圈≥20 mm为敏感，10～20 mm为中敏，≤10为耐药。

1.2.4 中药提取液体最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定 采用试管倍比稀释法测定中草药提取液对胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。在无菌条件下，将6种中药提取液分别倍比稀释成含药量为1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 g/mL的药液，然后分别加入扩培好的50 μL菌液，并设置相应的对照组，置二氧化碳培养箱中37 ℃培养24 h，通过观察试管内浑浊情况来判断细菌的生长情况。为了避免中草药提取液颜色对结果判定的影响，再将各试管内的培养液接种至大豆酪蛋白琼脂培养基平板上，置二氧化碳培养箱中37 ℃培养24 h，通过观察细菌在培养基上的生长情况来判定最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。培养基上有少量细菌生长即为该种药物对该菌株的最小抑菌浓度(MIC)，培养基上没有细菌生长即为该种药物对该菌株的最小杀菌浓度(MBC)。

2 结果与分析

2.1 中药提取液体外抑菌试验 六种中草药提取液体外抑菌试验结果如表1所示，百里香和芒果叶提取液抑菌效果较好，其抑菌圈直径分别为40 mm和35 mm，其次为白头翁、黄芩、穿心莲和苦参，其抑菌圈直径在8～16 mm。从表1可以看出，穿心莲对6株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌耐药，有三株对黄芩耐药，苦参对6株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌中敏，白头翁莲对6株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌中敏，芒果叶和百里香对6株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌高敏。

表1 抑菌圈测定结果(mm)

2.2 中药提取液最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定 六种中草药最小抑菌浓度测定结果(表2)可知， 六种中草药提取液对6株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌均有一定的抑菌活性，其中最小的抑菌活性为芒果叶和百里香0.198 mg/mL，最大的抑菌活性为穿心莲和苦参25 mg/mL，黄芩和白头翁为0.396 mg/mL。六种中草药最小杀菌浓度测定结果(表3)可知，百里香、芒果叶、白头翁、黄芩、穿心莲和苦参的最小杀菌浓度分别为0.396、0.396、0.792、0.792、50、50 mg/mL。说明除穿心莲和苦参外，其余4种中草药对胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株有很多好的抑菌和杀菌效果，其中百里香和芒果叶效果最佳。

表2 最小抑菌浓度测定结果(mg/mL)

表3 最小杀菌浓度测定结果(mg/mL)

3 讨论与结论

APP为条件性致病菌，是一种革兰氏阴性小球杆菌、线状或丝状杆菌，有荚膜和菌毛，不形成芽孢，能产生毒素。APP至今报道的有20多个血清型，各血清型之间的交叉免疫力能力差，所以该病的疫苗预防效果不理想。在选用疫苗前，最好做血清型鉴定，选用与本场血清型一致的疫苗，效果才好[22-25]。近年来，由于抗菌药物的不合理使用或者滥用，导致大量耐药菌的出现，出现多重耐药菌株或者超级耐药菌株，严重影响临床疗效和动物健康。

中草药是我国传统医学的瑰宝和宝贵遗产，是天然药物，天然污染小，资源丰富，价格低廉，易降解，具有高安全性、低毒性，含有多种活性成分，无残留、毒副作用小，过敏反应少，具有广谱抗菌作用且不易产生耐药性，不会造成环境重大污染等特点。中草药具有潜在的可开发成安全、环保、无抗、动物专用抗菌药物的价值，其抗菌效果的研究已经成为国内外关注的焦点和愈加受到科研工作者的重视[26-29]。中草药的抑菌、杀菌效果与其含有的抗菌有效成分和种类密切相关，中草药的有效活性成分主要包括生物碱类、香豆素类、醌类、木质素类、有机酸类、强心苷类、黄酮类、皂苷类、鞣质类、挥发油类、活性多糖类、环烯醚萜类、氨基酸、蛋白质和酶类、鞣质类等[30-33]。有的中草药虽然本身不具有抗菌特性，但其有效成分能够调节机体平衡和具有诱食作用，诱生多种细胞因子、免疫因子及通过激活补体和T、B 淋巴细胞的活性等途径来调节和增强动物的免疫功能，提高非特异性和特异性免疫应答，从整体上强化机体的免疫应答，提高抗病能力，从而对疾病有所控制，达到清热解毒和抗感染治疗的效果[34-35]。从中药具有提高动物的生产能力，提高免疫力，增强抗病力及治未病等方面，是抗生素、化学药物无法比拟的。但是抗生素的大量应用，给公共卫生安全和食品安全带来了极大隐患。因此，需找天然药物，为养殖业提供安全、无毒、高效、促进动物生产性能、不易产生耐药性的天然动物专用的抗菌药物迫在眉睫。

百里香(Thyme sp.)又名地椒、麝香草，为唇形科百里香属的多年生矮小灌木状草本，全株具有浓郁香味、可入药，是一种广泛应用的香料植物。百里香全草均含挥发油，以花盛时含量最高，其主要成分有，百里香酚(Thymo1)、对-聚伞花素(p-Cymo1)、芳樟醇(Linaloo1)、香芹酚(carvacro1)和龙脑等多种化合物[36]。百里香酚是一种单萜类化合物，抗炎作用是其多种药理活性之一，是百里香的主要成分。在多种药典和本草典中还记载百里香具有消炎止痛、温中散寒，健脾消食等药用作用。其抗菌功能与其含有的酚类物质密切相关，本研究发现百里香提取物具有较好的抑菌和杀菌功能，其有望作为替代抗生素的绿色饲料添加剂。其抗多重耐药菌的机制有待进一步研究。

芒果(Mangifera indica L.)系漆树科(Anacardiaceae)芒果属植物，广泛分布于热带和亚热带地区。芒果叶是常用中药，可用于治疗小儿疳积、气胀、热滞腹痛、消渴等症。研究表明，芒果叶中，含有大量的酚类化合物，如酚酸类、黄酮类、二苯甲酮类等，并具有多种生物活性，如抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗微生物、免疫调节、解热镇痛等。现代药理学研究表明，芒果叶提取物具有平喘、止咳、祛痰、免疫调节、抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤及治疗糖尿病等作用[37-38]。本研究通过对芒果叶提取物对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌的抑菌和杀菌试验表明，芒果叶提取物具有较好的杀菌和抑菌作用，其抑菌作用与其含有的酚类化合物密切相关，但其抑菌和杀菌机制有待进一步研究。由于其较好的抗菌作用，可以作为替代抗生素的绿色饲料添加剂应用于畜牧业生产和保障动物健康养殖。

综上所述，百里香和芒果叶对6株胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株具有较好的抑制作用，高度敏感，其抑菌圈直径分别为40 mm和35 mm，最小抑菌浓度分别为0.198、0.198 mg/mL，最小杀菌浓度分别为0.396、0.396 mg/mL；白头翁和苦参对6株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌中敏，6株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌对穿心莲耐药，有3株多重耐药胸膜肺炎放线杆菌对黄芩耐药。