不同化学物质建立肝损伤动物模型的作用机制

王雨欣王 倩田 颖

(1.扬州大学旅游烹饪学院,江苏 扬州 225127;2.扬州大学公共卫生学院,江苏 扬州 225009)

肝作为人体最大的解毒器官,主要负责清除体内产生的代谢废物和进入体内的有害物质,对机体起着重要的保护作用。 当肝受到损伤时,它的功能也会受到严重影响,导致过多的脂肪和有毒代谢物等的堆积,造成肝纤维化、肝衰竭等症状,甚至更严重的肝癌。 化学性肝损伤是指由有毒化学物质以及过量的酒精等引起的肝损伤[1],同时,剂量和时间的差异也会对肝损伤的程度产生不同的影响。 目前用于治疗化学性肝损伤的药物十分有限,过度使用护肝片等还可能会加重肝损伤[2],因此,研究具有不同作用机制的化学性肝损伤动物模型,有助于开发更多保肝护肝的保健食品和治疗肝病的有效药物。 本文从化学物质的作用机制出发,综述了不同作用机制的化学物质引起动物肝损伤的途径和优缺点,为后续研究提供了更多的可能性靶点。

1 氧化应激

1.1 四氯化碳

四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)作为工业上广泛使用的一种有机化学毒物,易被肝吸收,现已成为建立化学性肝损伤模型最为常用的化学物质[3],其作用机制主要是通过氧化应激反应及其导致的炎症反应造成肝细胞损伤。 CCl4进入机体后,可经细胞色素酶P450(cytochromeP450,CYP450)代谢成为三氯甲基自由基(·CCl3)、三氯甲基过氧自由基(CCl3OO ·) 等 活 性 氧 自 由 基。 活 性 氧(reactive oxygen species,ROS)大量累积,进而与肝细胞膜上的大分子共价结合,诱导肝细胞膜脂质过氧化,引起膜结构与功能受损,导致肝细胞发生氧化应激反应;其次,·CCl3会直接攻击肝细胞线粒体,抑制膜上钙泵的活性,导致膜内外钙离子浓度失衡,从而影响肝细胞的代谢功能,导致肝细胞坏死。 在氧化应激状态下, 超氧化物歧化酶(superoxide dismutases,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)作为肝细胞内重要的抗氧化酶,会被大量消耗,含量显著下降。 相反, 脂质过氧化反应的终产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量会显著上升。 CCl4代谢产物可激活肝枯否细胞,释放大量促炎因子[4],刺激免疫细胞释放高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)[5],其主要受体之一Toll 样受体4(toll-like receptor4,TLR4)被激活,使 IL-1 受体相关激酶( interleukin-1 receptorassociated kinase,IRAK)与髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)解离并进入胞浆内,进而激活肿瘤坏死因子受体相关因子-6(tumor necrosis factor receptor associated factor-6, TRAF-6)[6],诱导IκB 激酶(IκB kinase,IKK)复合物磷酸化,使核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路的关键蛋白分子NF-κB p65 被转运到肝细胞核内并与特定DNA 序列结合,导致肝细胞产生炎症反应。 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NODlike receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)作为NOD 样受体家族中最为重要的一员,可被TLR4 信号激活形成NLRP3 炎症小体,进而促进白细胞介素-18(interleukin 18,IL-18)等炎症因子的成熟与释放[7]。 进入肝细胞的TLR4 信号诱导产生大量NLRP3 炎症小体,进一步促进炎症因子释放,导致炎症级联放大反应[8],造成炎症反应的恶性循环,加剧肝细胞损伤与凋亡。 此外,CCl4还可上调转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的表达[9],从而激活肝纤维化的关键细胞——肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs),进而刺激成纤维细胞生成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度表达,诱导肝纤维化,导致肝损伤加重。

CCl4诱导的化学性肝损伤模型操作简单,成本低,能在较短时间内建立理想的化学性肝损伤模型。 此外,其症状与人肝损伤较为相似,稳定性强。因此,CCl4是建立化学性肝损伤动物模型的首选化学物质。 但CCl4毒性较大,除肝外还会损伤其他脏器,特异性较低,因此CCl4诱导的化学性肝损伤模型不适用于免疫机制等方面的研究[10]。

1.2 硫代乙酰胺

硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)是工业上的杀菌剂,具有很强的肝毒性,其诱导肝损伤的机制与CCl4相似,均可促使肝细胞发生氧化应激和脂质过氧化反应。 TAA 经细胞色素P450 家族成员2E1(CYP2E1)活化,转化为TASO2(CH3CSO2NH2),可与磷脂酰乙醇胺脂等大分子共价结合,促进脂质过氧化,提高MDA 水平并降低SOD 和GSH-Px 活性,白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子大量释放,进而激活NLPR3 炎症小体,同时,TLR4/NF-κB 通路和TGF-β1 通路被激活,加剧炎症反应与肝纤维化进程。 磷脂酰肌醇- 3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路与多种肿瘤密切相关,其活性异常可引起肿瘤细胞的增殖与迁移[11]。 TLR4 信号可激活PI3K/Akt 通路,促进肿瘤细胞增殖,进而可能会演变成肝癌。 另外,c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路可参与细胞凋亡、分化等过程[12],其上游因子细胞凋亡信号调节激酶1 (apoptosis signalregulated kinase 1,ASK1)对氧化应激高度敏感,过度活化后可激活JNK 通路。 过量的TAA 可促进ASK1 磷酸化,激活JNK 信号通路,从而诱导抗凋亡基因B 淋巴细胞瘤-2 基因(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和促凋亡基因Bcl-2 相关X 蛋白基因(bcl-2-associated X protein,Bax)表达失衡[13],导致Bax 蛋白表达增加并向线粒体膜外移动,增加线粒体通透性,释放细胞色素c,诱导线粒体功能障碍与凋亡诱导分子释放,破坏细胞修复过程。

TAA 造模可重复性高且不易逆转,诱导的肝纤维化模型与人肝纤维化相似,适合用于筛选抗纤维化药物等。 然而,目前没有对TAA 造模的剂量研究,因此造模之前需要查阅大量文献并进行预实验来确定最佳剂量。

氧化应激是化学物质致肝损伤最为常见的作用机制,除CCl4、TAA 外,甲苯二异氰酸酯(toluene diisocyanate,TDI)[14]、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)[15]等化学物质也可通过诱导氧化应激和脂质过氧化诱导肝细胞损伤。

2 干扰RNA 合成

D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)进入机体后可在半乳糖激酶和半乳糖-1-磷酸尿酰转移酶的作用下与三磷酸尿苷(uridine triphosphate,UTP)结合形成稳定的尿苷衍生物UDP-D-GalN,即通过消耗肝中的UTP 来抑制依赖UTP 的RNA 等大分子合成,导致肝细胞炎症和坏死[16],是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂。 同时,D-GalN 可促进ROS 释放,刺激肝细胞发生氧化应激反应,诱导肝细胞膜脂质过氧化并干扰线粒体正常功能,进而促进炎症因子表达,引起肝细胞损伤[17]。 此外,D-GalN 还可诱导肥大细胞细胞质中钙离子水平的增加,从而破坏肝细胞膜结构,促使肝细胞凋亡。 使用D-GalN 造模时一般将其与脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)或肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)联合使用,增强其肝毒性。 LPS 作为一种内毒素,可诱导单核细胞趋化蛋白- 1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的表达,从而特异性激活单核细胞、巨噬细胞等[18],进而参与体内免疫应答与炎症反应[19]。 此外LPS 还可以与血浆中的脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)结合形成复合体,再与肝细胞表面的分化抗原簇基因14(cluster of differentiation 14,CD14)、骨髓分化因子2(myeloid differentiation factor 2,MD2)受体结合,从而激活TLR4。 D-GalN/LPS 可识别并激活TLR4/NF-κB 通路,炎症因子表达量迅速升高并进一步激活体内的免疫应答,造成炎症因子级联放大,加重肝损伤,甚至导致重症肝炎等不可逆肝疾病。 TNFα 是一种炎症因子,肝受损后会大量释放,刺激机体发生炎症反应,并可直接破坏内皮细胞,导致肝细胞坏死[20]。 D-GalN 联合TNF-α 主要通过内源性和外源性凋亡信号途径诱导化学性肝损伤[21]。 内源性凋亡信号途径是通过激活JNK 信号通路,增加Bax 蛋白表达,引起线粒体膜通道孔通透性增加与细胞色素c 的释放,诱导产生凋亡级联反应。 外源性凋亡信号途径是将TNF-α 与细胞表面TNF-α 受体1(TNFR1)结合,激活Caspase-3,上调Bax 基因,进而激活内源性凋亡途径[22]。

D-GalN 是构建肝损伤和肝衰竭模型相对合适的化学物质,其特异性强,不会损害其他器官,但价格较高,且不同品系动物之间剂量差别较大,短期死亡率高,故应用范围小于CCl4和TAA。

此外,α-鹅膏毒肽也可通过阻断RNA 聚合酶从而抑制RNA 合成[23]。

3 影响酶的活性

人体代谢酒精途径主要有两种:酒精脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH) 途 经 和CYP2E1 途径[24]。 大多数酒精在ADH 的作用下利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)转化为乙醛并产生NADH,进而转化为无毒无害的代谢产物从体内排出[25];少量经CYP2E1 代谢,从呼吸和尿液中排出,同时会累积少量ROS。与ADH 作用相同的酶还有过氧化氢酶(catalase,CAT),CAT 也可以参与到酒精代谢过程中。 长期或过量摄入酒精会降低NAD 与NADH 的比例(NAD+/NADH),导致肝中过度脂肪堆积,形成脂肪肝;同时,ADH 与CAT 活性降低,导致CYP2E1 代谢增加及ROS 过量累积,促进肝细胞发生氧化应激反应,激活TLR4/NF-κB 通路,加快肝损伤进程。 ROS还会诱导线粒体细胞色素c 的释放,通过合成凋亡小体,进而激活Caspase-3,引起线粒体DNA 降解和肝细胞凋亡。 长期暴露于酒精还会改变肠道微生物群和通透性,肠道中的LPS 进入肝,激活肝枯否细胞且与TLR4 作用,加重炎症反应。 在酒精的刺激下,巨噬细胞被激活,从而释放大量促炎因子和趋化因子来损害肝,增加硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)的表达,进而促进Caspase-1 介导的细胞凋亡通路,诱导肝炎症反应[26]。 此外,酒精在代谢过程中会形成多种蛋白质加合物并影响内质网中的蛋白质折叠,在正常状态下,肝细胞通过激活未折叠蛋白来维持内质网稳态,而过多酒精的会降低肝酶的活性,从而导致错误折叠蛋白和未折叠蛋白的大量堆积,引起内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress,ERS)[27]。当肝细胞处于内质网应激状态时,蛋白激酶R 样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)被过量的未折叠蛋白激活,从而使真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)磷酸化,诱导活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的转录,从而上调C/EBP 环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)的表达[28-29],进而诱发肝细胞凋亡级联反应, 导致肝细胞凋亡[30-31]。

酒精性肝损伤模型具有较高的造模率,对临床研究具有重要意义,可用于开发更多预防酒精性肝损伤的保健食品和药物。 但酒精造模存在品系和性别差异,部分动物模型成本高,且缺乏统一的造模标准。

异烟肼的作用机制与酒精类似,通过抑制线粒体中酶的活性[32],干扰正常的能量代谢,导致肝细胞凋亡,从而造成肝细胞损伤。

4 诱导胆汁淤积

胆汁淤积通常伴随着胆汁酸在肝中过度积累,最终导致肝受损,如果不及时治疗,会导致肝纤维化、肝硬化等严重后果。 用于诱导胆汁淤积性肝损伤模型的主要化学物质是α-萘异硫氰酸酯(αnaphthyl isothiocyanate,ANIT),其诱导的模型与人胆汁淤积症临床病理相似度较高。 ANIT 进入机体后可与谷胱甘肽(glutathione,GSH)结合,由于结合不稳定,ANIT 结合物在胆管中分解,直接损伤胆管上皮细胞,引起胆管周围炎症,导致胆汁堵塞和淤积,最终导致肝细胞损伤。 正常状态下,胆汁酸可激活法尼醇受体(farnesoid X receptor,FXR),促进其与小异二聚体伴侣(small heterodimer partner,SHP)的结合,通过多种途径抑制胆汁酸的合成、转运、重吸收等[33-34],从而阻止肝细胞进一步损伤。 ANIT 可下调FXR 表达,导致FXR 与SHP 结合减少,降低其负反馈抑制细胞色素 P450 家族成员 7A1(CYP7A1)基因转录的能力[35],导致CYP7A1 表达增加,进而加速胆固醇转化为胆汁酸,增加胆汁酸合成。 钠离子牛磺酸共转运多肽(Na+dependent taurocholate cotransporter,NTCP)与阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides,OATPs)是胆汁酸转运的主要转运蛋白,大约90%的胆汁酸都由NTCP 转运[36]。 FXR 与SHP 结合减少导致NTCP与OATPs 表达减少,导致肝胆汁酸重吸收减少。 人成纤维细胞生长因子15/19(fibroblast growth factor 15/19,FGF 15/19)可通过抑制胆汁酸合成从而参与体内脂质、葡萄糖等调节过程[37]。 FXR 的下调可导致FGF 15/19 的表达和分泌减少以及CYP7A1 表达的增加,进一步促进胆汁酸的合成[38]。 FXR 下调还可降低胆汁酸盐输出泵(bile salt export pump,Bsep)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistanceassociated protein 2,Mrp2)的表达,减缓胆汁酸的排泄与转运,导致胆汁酸在肝中淤积。 细胞色素P450家族中3A4 (CYP3A4)[39]、胆汁酸辅酶A 合成酶(BACS)等代谢酶可增加胆汁酸的亲水性并促进胆汁酸的排泄。 FXR 下调会导致CYP3A4、BACS 等代谢酶表达下降,对胆汁酸的解毒作用减弱,大量有毒胆汁酸淤积在肝中,最终导致严重的肝损伤。ANIT 还可以降低肝的抗氧化防御能力,促使中性粒细胞产生大量ROS,导致肝氧化应激和炎症。

ANIT 诱导的胆汁淤积性肝损伤模型操作简便可靠,能很好地模拟了人胆汁淤积症,然而,ANIT 的灌胃给药对研究人员的操作水平有一定要求,且可能会对胃肠道造成损害,影响需口服或灌胃药物的疗效[40]。

此外,由3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6 - 三甲基吡啶( 3, 5-diethoxycarbonyl-1, 4-dihydrocollidine,DDC)[41]诱导的胆汁淤积性肝损伤模型也常用于人胆汁淤积症的研究。

5 促进肿瘤细胞生成

二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine,DEN)是一种广泛存在于自然界的致癌物质,具有高度活性,对人和动物都有致癌性,且对肝具有特异性,经口摄入可能造成严重的肝损伤[42],低剂量DEN 可改变肝结构并诱导肝纤维化,同时可促进肝癌的典型特征,如肝细胞增生、癌细胞增殖等,因此DEN 常用于建立动物肝纤维化和肝癌模型。 DEN 在体内主要被CYP2E1 羟基化,然后分解成具有高亲电活性的碳正离子等,导致DNA 烷化损伤和肝细胞损伤,进而可能诱发癌症[43]。 由CYP3E1 代谢过程中释放的大量ROS 则会导致氧化应激损伤。 DEN 代谢同时产生的重氮化合物在肝细胞DNA 合成过程中与碱基结合,引起碱基错配或转录异常,导致DNA 突变和肿瘤细胞生成。 谷胱甘肽S-转移酶P1(glutathione S-transferase P1,GSTP1)是谷胱甘肽巯基转移酶家族的成员,可通过代谢多种致癌化合物来避免细胞DNA 损伤[44-45]。 抑癌基因启动子区CpG 岛的高甲基化会导致染色质空间结构的改变,从而阻止基因转录,并使抑癌基因沉默[46]。 DEN可诱导Gstp1 启动子高甲基化,降低Gstp1 表达,使其代谢DEN 化合物能力下降,同时抑癌基因沉默,导致肝细胞DNA 严重受损以及肿瘤细胞大量生成。信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是IL-6/STAT3 通路中的一个重要信号因子,可经IL-6 激活后进入细胞核内与DNA 应答元件结合,调节细胞内DNA 的转录和活性,上调Bcl-2 等基因表达,从而促进肿瘤细胞增殖以及抑制肿瘤细胞凋亡[47]。 核受体共刺激因子5(nuclear receptor coactivator 5,NCOA5)是一种核受体辅助调节因子,能抑制肝炎症的相关因子释放,进而抑制其下游的STAT3 通路[48]。 DEN可抑制NCOA5 表达,随后上调STAT3 表达,激活IL-6/STAT3 信号通路,导致炎症因子大量释放,同时Bcl-2 等基因表达增加,导致大量肿瘤细胞增殖且凋亡受到抑制,促使肝癌发生。

DEN 常用于诱导原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)模型,便于更好地了解人HCC,剂量、暴露时间等均会影响DEN 诱导肝损伤的特征。 DEN 肝癌造模时间较长,死亡率高,毒性大,实验操作时需要注意人员安全问题。

类似机制的化学物质还有黄曲霉素 B1(aflatoxin B1,AFB1)[49],也可以通过改变DNA 结构从而促进肿瘤细胞的增殖与迁移,进而引发肝癌。

6 总结与展望

本文主要介绍了CCl4、TAA、D-GalN、酒精、ANIT 和DEN 致动物肝损伤的作用机制,主要有以下5 种:(1)氧化应激;(2)干扰RNA 合成;(3)影响酶的活性;(4)诱导胆汁淤积;(5)促进肿瘤细胞生成。 肝损伤是许多肝疾病研究的起点,了解不同化学物质致肝损伤的作用机制,可以探索更多有效治疗化学性肝损伤的活性物质。 以上5 种作用机制都可以作为化学性肝损伤研究的重点,可以为研究保肝护肝的保健食品和治疗药物提供更多选择。