脂肪源性间充质干细胞治疗绝经后骨质疏松症的研究进展*

赵 娟， 舒 晴， 田 峻△

1武汉体育学院健康科学学院，武汉 430079 2武汉大学中南医院康复医学科，武汉 430071

最新流行病学调查显示，近年来，绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)发病率呈明显上升趋势，在美国估计有1000万50岁人群患有髋关节骨质疏松症，每年约有150万例骨质疏松性骨折[1]。在欧洲，估计有2760万人患有年龄相关性骨质疏松症，其中350万人发生了骨折[2]。我国50岁以上女性PMOP发病率高达32.1%，显著高于全球平均水平[3]，严重影响患者的身体健康和生活质量。PMOP主要表现为骨量流失、骨质脆性增加，骨折风险增加[4]。临床上对于PMOP的发病机制尚未完全阐明，目前认为可能是由于各种原因造成了成骨细胞与破骨细胞的关系失衡[5]。临床上对于PMOP的治疗以药物为主，虽然有一定效果，但也存在不可避免的副作用[6]。PMOP的治疗药物主要包括骨吸收抑制剂(如二磷酸盐类、雌激素受体调节剂)、骨形成促进剂(如甲状旁腺激素)、骨矿化物(钙剂和维生素D)[7]。但长期使用雌激素受体调节剂会增加乳腺癌的发生风险，骨矿化物只能起到补充骨基质的作用，仅能作为辅助治疗[8]。因此，为了寻找更加理想的治疗手段，研究者把目光投向了间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。

1 MSCs概述

MSCs是一类存在于骨髓、脐带血、脂肪、肝脏等组织中且具有多向分化潜能的原始细胞，有着极强的自我增殖和更新能力[9]。根据MSCs来源不同，可分为骨髓源性间充质干细胞(BMSCs)、脂肪源性间充质干细胞(ADSCs)、骨骼肌源性间充质干细胞(MDSCs)、滑膜源性间充质干细胞(SMSCs)等[10]。研究表明，来源于人机体不同部位的MSCs其表面分子标记不同，BMSCs高表达CD271，而ADSCs则高表达CD10、CD13、CD49d、CD29等[11-12]。近年来，干细胞疗法作为当前医疗领域的热点，因干细胞的多向分化潜能引起了广泛的关注和研究，并开展了越来越多的临床研究[13]。

2 MSCs在PMOP中的应用

现有研究表明，MSCs可以分化成为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种组织细胞[14]。因此，MSCs移植有望成为PMOP治疗的新策略和新方法。

2.1 现有MSCs治疗PMOP的优势与不足

目前应用于PMOP防治研究的干细胞主要有BMSCs、MDSCs、ADSCs等，而BMSCs在防治PMOP中应用是最多的[15]。PMOP的发生与机体内MSCs的成骨分化能力降低有关，而大量实验研究证明，MSCs的成骨分化能力使其具备治疗骨质疏松症的强大潜力[16]。同时，PMOP还与机体内MSCs的数量下降有关[17]。BMSCs移植疗法，从根源上补充了PMOP患者体内与成骨有关的原始细胞，解决了原始细胞不足问题[18]。因此，BMSCs移植可以有效避免药物治疗的毒副作用，是一种较为绿色的治疗手段。

但是BMSCs疗法也存在诸多不足之处。BMSCs虽然在体外分化较为迅速，但PMOP患者体内BMSCs的成骨分化潜力仍然不足[19]；另外，由于骨髓在人体含量相对较少，而BMSCs在骨髓当中又很少见，因此要获得足够数量原代培养的BMSCs比较困难；而且获取BMSCs需要反复抽吸骨髓导致患者接受度不高，这些都是目前限制其临床应用的重要原因[20]。可见BMSCs的临床应用仍存在较大局限性。因此，就需要寻找一种更为理想的MSCs。

2.2 ADSCs治疗PMOP的优势

ADSCs存在于脂肪组织中，大量实验研究证明了ADSCs在成骨分化、自我更新、快速增殖等方面的潜力及改善PMOP的有效性[21]。另外，在骨质疏松动物模型中提取的ADSCs具有和健康动物相似的成骨分化潜能[22]；人源ADSCs相比BMSCs受到年龄和多代传代的影响也更小[23]，为骨质疏松症患者进行自体ADSCs移植提供了可能。另外，在成骨微环境中，ADSCs不受雌激素缺乏的影响仍可以促进骨组织的形成，为因雌激素缺乏而导致的PMOP治疗提供了希望[24]。还有研究表明ADSCs表达的趋化因子CXCL12是BMSCs的3倍，进而能更好地促进小鼠造血干细胞归巢到骨髓[25]。以上研究说明，ADSCs在干细胞疗法治疗骨质疏松上具有很强的潜力，甚至可能比BMSCs更有优势。

3 ADSCs治疗PMOP的有效性

ADSCs从首次被发现到现在，许多学者都相继用实验证明了其成骨分化、自我更新、快速增殖等方面的潜力及对于PMOP治疗的有效性[26]，这为ADSCs的临床应用提供了理论依据。

3.1 ADSCs体外成骨分化证据

研究人员从棕熊的体内提取出ADSCs并进行体外单层培养，结果发现在没有特定诱导剂的情况下ADSCs也能在体外自发进行成骨分化[27]。此外，从去势骨质疏松动物模型皮下脂肪组织中获取的ADSCs，经过体外培养，其成骨分化潜能与健康动物相似[22]。由此可见，ADSCs在体外有良好的成骨分化能力。

3.2 ADSCs体内移植治疗PMOP的实验研究

大量动物实验证明，ADSCs无论通过局部移植还是系统移植均能有效地增加骨密度，改善PMOP。研究表明，在去势骨质疏松大鼠股骨近端植入自体ADSCs，可促进骨再生，增加骨强度[28]。同时，从去势兔股骨远端植入自体ADSCs，其成骨细胞分化能力显著增强，新骨形成明显增多，骨密度增加[29]。Mirsaidi等[30]的研究也发现自体ADSCs胫内移植可使骨质疏松大鼠骨小梁数量增加，骨密度显著升高。由此可见，局部自体移植ADSCs能改善骨的微细结构，增加成骨能力，从而改善PMOP。

另外，ADSCs的系统移植也被应用于治疗PMOP。研究发现，通过尾静脉注射将ADSCs移植到去势骨质疏松模型大鼠体内，骨矿盐含量提高，骨形态改善，骨密度增加[31]。因此，全身ADSCs移植后能够改善去势骨质疏松大鼠的骨量流失，对骨质疏松具有预防作用[32]。同时，经尾静脉注射ADSCs可以有效促进去势大鼠的骨形成，抑制破骨细胞活性，改善骨质疏松病理结构，对去势大鼠骨质疏松具有一定的治疗作用[33]。另外，将ADSCs系统移植到去势小鼠体内可发现ADSCs能分泌多种骨细胞激活因子，包括干细胞生长因子和细胞外基质因子，从而防止骨丢失[34]。这些研究支持ADSCs作为一种基于自体细胞的方法来治疗PMOP[35]。

4 ADSCs成骨分化的调控通路及分子机制

目前为止，ADSCs成骨分化的分子机制尚未完全阐明。许多学者经过探索，提出了一些可能的通路机制。

4.1 MAPK/PI3K-Akt信号通路

研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、PI3K-Akt信号通路可能参与了ADSCs的成骨分化调控[36]。在去卵巢大鼠体内自体ADSCs移植，用MAPK/细胞外信号调节激酶(ERK)1/2抑制剂或PKA抑制剂作用于ADSCs，可显著抑制成骨标志物的表达，这表明ADSCs成骨的诱导依赖于ERK和PKA信号通路[37]。另有研究表明，ADSCs条件培养液通过Smad蛋白/ERK/JNK(c-junnh2末端激酶)的激活促进成骨细胞的增殖和分化，通过ERK/JNK/p38的激活促进破骨细胞的存活和分化，ADSCs分泌的旁分泌因子可以改善骨修复[34]。由此可见，MAPK信号通路可能是PMOP的候选通路机制。

同时，研究发现转录共激活因子TAZ是促进ADSCs发挥成骨细胞谱系作用的关键介质，在ADSCs中激活TAZ可能成为一种可行的促进骨再生和修复的方法[38]。且TAZ可以通过PI3K/Akt信号通路促进骨质疏松大鼠MSCs的成骨分化[39]。研究表明，ADSCs中RhoA活性蛋白和岩石底物分子p-MYPT1的高表达可促进其成骨分化，而RhoA抑制剂可抑制TAZ激活，从而抑制ADSCs增殖和成骨分化。而siRNA转染敲除TAZ后，显著抑制了ADSCs的增殖和成骨分化。由此可见，RhoA活性蛋白表达不受TAZ特异性siRNA转染的影响，提示RhoA位于TAZ的上游。综上所述，RhoA-TAZ信号通路的激活可促进ADSCs的增殖和成骨分化[40]。

4.2 TGF-β/BMP-2信号通路

研究表明，成骨诱导ADSCs的机制可能是通过激活BMP-2/BMP受体ⅠB型信号通路，促进ADSCs的成骨和抑制脂肪生成的[41]。

另外，microRNA也参与了BMP-2的调控。研究发现，通过RNA干扰(RNAi)下调基因内BMP-2的表达，能抑制骨生成和增加脂肪生成，而miR-17-5p和miR-106a上调也可达到同样的效果。miR-17-5p和miR-106a促进ADSCs成骨和抑制其成脂的作用可被BMP-2 RNA干扰逆转。因此，miR-17-5p和miR-106a通过直接靶向BMP-2调控ADSCs的成骨和成脂，从而降低成骨TAZ、MSX2和Runx2，增加成脂C/EBPα和PPARγ[42]。由此可见，BMP-2可能是miR-17-5p和miR-106a的直接靶点。因此，BMP-2可能是PMOP成骨分化的潜在通路机制。

4.3 Wnt信号通路

研究发现，PTH1-34可以磷酸化SIK2，上调RANKL，下调SOST，从而上调Wnt4，促进ADSCs的成骨过程。虽shRNA干扰Wnt4表达对上游蛋白RANKL、SOST的表达影响不大，但会影响其他下游成骨蛋白Runx2、Osterix、骨钙素的表达，进而抑制ADSCs的成骨过程[43]。此外，rhRunx2修饰的ADSCs基因治疗促进了骨质疏松的下颌骨新骨形成，能有效弥补系统性骨质疏松对新骨形成的不利影响[44]。因此，ADSCs的成骨应考虑到Wnt信号通路的调控作用。

4.4 miRNA参与ADSCs成骨分化的机制

miR-429在PMOP患者血清中表达明显上调。在成骨分化过程中，过表达miR-429可显著降低ALP活性。同时，miR-429可以与SCD-1结合并负调控其在ADSCs中的蛋白水平，使SCD-1在ADSCs成骨分化过程中明显下调。此外，沉默SCD-1可抑制成骨相关基因表达、ALP活性和钙化能力。且miR-429通过下调SCD-1抑制ADSCs的成骨分化[45]。因此，miR-429可能是ADSCs成骨的潜在靶点。circFOXP1在PMOP患者骨组织中明显下调，但circFOXP1结合miR-33a-5p通过靶向FOXP1促进ADSCs成骨分化。因此，circFOXP7ay可通过促进ADSCs成骨分化来预防PMOP，可作为PMOP患者体内ADSCs成骨的候选治疗靶点[46]。另外，研究表明下调miR-10b可以通过调控CEBPα表达水平促进小鼠ADSCs的成骨分化进程。因此，miR-10b作为成骨分化的负向调节因子可能成为PMOP潜在的干预靶点[47]。

4.5 其他信号通路

研究发现，Nell-1处理能增加Hedgehog信号通路表达，从而促进ADSCs成骨分化。这表明，Hedgehog和Nell-1信号通路可能是ADSCs成骨分化的可能信号通路[48]。

另外，对ADSCs中锌脂蛋白467(Zfp467)的RNA干扰抑制了脂肪细胞的形成，并刺激了成骨细胞的形成。si-Zfp467可调控ADSCs中成骨和成脂标志物mRNA水平。在去势骨质疏松小鼠模型中，ADSCs中的Zfp467 RNAi可以恢复骨功能和结构。由此可见，Zfp467是ADSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化的可能作用靶点[49]。

C5AR1的表达水平在ADSCs成骨分化过程中显著升高。C5AR1的下调显著降低了成骨分化标志物的表达水平和钙结节形成能力。C5AR1可能是ADSCs成骨分化所必需的新基因和途径，操纵这个候选基因的水平可能有助于PMOP的治疗[36]。

5 ADSCs成骨分化的影响因素

迄今为止，有很多研究证据表明，ADSCs成骨分化受多种因素调控。合理地利用这些诱导因素，深入探讨ADSCs成骨分化的精确调控机制，可为ADSCs防治PMOP提供更可靠的证据。

5.1 激素

某些激素的水平可以影响ADSCs的分化能力，如甲状旁腺激素能在ADSCs成骨方面发挥作用，其可能是通过调节SIK2和Wnt4影响ADSCs的成骨过程[43]。且与其他MSCs不同的是，ADSCs不受雌激素缺乏的影响，具有更好的成骨优势[24]。

5.2 药物

在去势骨质疏松大鼠模型中，阿司匹林可抑制血清中肿瘤坏死因子和干扰素-γ等促炎细胞因子水平，其抗炎能力与骨形态计量学呈正相关。由于阿司匹林在体外具有良好的趋化作用，并可在体内早期加速同种异体ADSCs的归巢进入骨髓，因此，阿司匹林联合异基因ADSCs能部分逆转去势PMOP大鼠骨丢失[50]。阿司匹林促进ADSCs的增殖和成骨分化的机制，可能是通过Wnt及TGF-β信号通路来实现的[51]。

同时，许多中药或中药成分也能促进ADSCs成骨分化能力，其中左归丸和右归丸均可上调成骨诱导后ADSCs中β-catenin、Lef-1及Wnt3a蛋白，由于右归丸可显著提高ADSCs成骨分化早期的ALP表达量，可明显促进成骨细胞的成熟及矿化，作用效果更为显著[52-53]。同时，葛根素也在ADSCs成骨分化过程中有积极影响，去势骨质疏松大鼠ADSCs成骨分化能力与加入含葛根素培养液的时间和培养液中葛根素的浓度呈正相关，浓度为12 mmol/L时呈现无毒剂量下促进成骨分化的作用最显著[54]。另外，中药骨康含药血清培养脂肪干细胞移植可促进骨质疏松性骨折愈合[55]，其可能是通过促进CBFA1和OCN的表达实现的[56]。有研究表明，特定条件下大豆苷类似物能使BMSCs和ADSCs关键成骨基因(RUNX2、c-FOS、SPARC、DLX5、SPP1、COL1A1、IGF1、SOST和DMP1)表达增加，提前诱导这些谱系特异性基因能通过大豆苷类似物激活不同的雌激素受体(ER)和非雌激素受体(non-ER)途径来诱导BMSCs和ADSCs的分化[57]。且柚皮苷对氧化应激诱导的ADSCs成骨分化的抑制具有保护作用，其作用可能与Wnt信号通路有关[58]。

5.3 年龄

现有研究发现，衰老能降低ADSCs成骨分化效率和潜能[59]。尽管年龄对间充质细胞的成骨分化能力有影响，但有学者将去势骨质疏松模型大鼠ADSCs与正常老龄大鼠的ADSCs进行对比研究，结果发现其成骨向分化能力无明显差别[60]。老龄骨质疏松大鼠的ADSCs也可以考虑作为种子细胞促进其自体骨愈合。

5.4 其他因素

研究发现，低频脉冲电磁场可在早期刺激ADSCs的细胞增殖，随后促进骨相关基因表达和诱导相关蛋白的表达以刺激成骨分化[61]。同时，向正宗等[62]认为电磁场可以诱导ADSCs成骨分化。由此可见，电磁场等物理疗法也可以促进ADSCs的成骨分化能力。

且有大量研究表明，针灸能对骨质疏松的成骨通路进行调控如Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP-2等[63]。同时可以使PMOP患者体内骨形态生发蛋白2的含量和功能增强，从而诱导成骨分化与增殖[64]。有学者还发现电针可以通过调节Wnt信号通路的转导来影响骨代谢[65]。据此，我们推测针灸也可能是一种调控ADSCs成骨分化的潜在有效手段。

6 ADSCs治疗PMOP的临床应用潜力

研究者通过对30名女性骨质疏松患者ADSCs进行研究，发现人类ADSCs也能进行成骨分化[45]。有学者分别从年轻和老年PMOP患者的体内提取出ADSCs进行研究，结果表明两者的ADSCs都可发生成骨分化和增殖[23]。同时，将PMOP患者的ADSCs放入条件培养液后，成骨潜能显著提高[30]。由此可见，人来源的ADSCs具有一定的成骨潜能，而且PMOP患者的ADSCs也同样具有成骨能力，也可考虑作为移植的细胞来源。

7 总结与展望

综上所述，ADSCs在改善骨质疏松方面具有广泛的应用前景。由于ADSCs移植治疗PMOP的诸多优势，在组织工程技术成熟的基础上，ADSCs移植治疗PMOP将很可能广泛应用于临床实践，为骨质疏松患者带来福音。如今，应用ADSCs移植治疗PMOP仍然存在许多问题,如：调控机制通路仍未完全阐明，无法进行精准控制其分化方向；注射用量及注射途径尚无统一共识；合适的细胞培养代数选择及移植后细胞迁移与归巢问题等。这些问题仍然需要我们进一步研究和讨论,ADSCs真正应用于PMOP患者还有很长的路要走。