10种农业化学品对柑橘内生菌枯草芽孢杆菌L1-21的影响

李咏梅， 蒋佳容， Shahzad MUNIR， 何鹏飞， 吴毅歆， 谢金思， 潘祖贤， 何鹏搏， 何月秋*

1云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201； 2云南农业大学农学与生物技术学院,云南 昆明650201

柑橘CitrusreticulataBlanco在生长期间，各种病虫害，如红蜘蛛TetranychusurticateKoch、潜叶蛾PhyllocnistiscitrellaStainton、蚜虫Aphiscitricolavan der Goot、凤蝶PapilioxuthusL.、蓟马ScirtothripscitriMoulton、木虱DiaphorinacitriKuwayama等发生普遍。在我国南方，红蜘蛛几乎无越冬现象，年发生20多代，危害极其严重。又如柑橘溃疡病、疮痂病、黄龙病给柑橘产业造成了巨大损失。为控制溃疡病和疮痂病，橘农不得不大量施用广谱杀菌剂，如铜制剂的波尔多液、氢氧化铜、喹啉铜等；为控制柑橘黄龙病，常喷施吡虫啉、辛硫磷、高效氯氰菊酯、噻虫嗪防治传病媒介——柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama(陈国庆等，2012； 宋晓兵等，2015)。为了节约时间和降低劳动强度，用户常将不同农药混用(华飞雯，2016； 吴志华，2015)，或者大量施用保险药，从而出现滥用、乱用农药现象。

柑橘植株体内存在大量的内生菌，包括真菌、细菌和放线菌等(郑雪芳等，2012； Munir etal.,2018)。这些内生菌经过与柑橘长期共同进化，成为健康植株不可或缺的一部分。然而，人们在喷施各类化学农药时，主要针对目标病虫害，并未考虑内生菌。采用广谱性农药单施或者2种及2种以上药剂混施，不可避免地杀死大量有益内生菌。枯草芽孢杆菌BacillussubtilisL1-21为一株分离自柑橘叶片的有益内生细菌，可定殖于柑橘叶片内(Muniretal.,2018)。为了明确化学农药及微肥对内生菌的影响和指导用药与施肥，本文采用枯草芽孢杆菌L1-21为指示菌，测定6种杀虫剂、3种杀菌剂和1种微肥在实验室条件下与大田中对该菌株的抑制活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培养基及培养条件 枯草芽孢杆菌 L1-21(下称L1-21)，由本实验室自健康柑橘叶片上分离并保存，属内生菌。该菌株菌落背面呈品红色，边缘有火山口样皱叠，易于识别。L1-21菌株的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记菌株L1-21-GFP由本实验室构建。

除有特殊说明之外，L1-21的常规培养基为LB固体或液体培养基。供试的10种农业化学品先用无菌水稀释至一定浓度，依照设定的浓度梯度，利用1/1000电子天平精确称取，添加到已灭菌并冷却到50 ℃上下的定量LB培养基中，混匀后倒入培养皿中制成平板待用。液体培养条件为37 ℃、160 r·min-1振荡培养，固体培养在37 ℃温箱中进行。L1-21-GFP所用培养基中含终浓度10 μg·mL-1的氯霉素(Cm)。

1.1.2 供试农业化学品 杀虫剂6种：70%吡虫啉水分散粒剂(山东滨农科技有限公司)、21%虫螨腈悬浮剂(广东植物龙生物技术有限公司)、25%噻虫嗪水分散粒剂(河南田丰上品生物科技有限公司)、1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂(山东省青岛泰生生物科技有限公司)、40%辛硫磷乳油(江苏省徐州市临黄农药厂)、5.7%氟氯氰菊酯水乳剂(山东省绿士农药有限公司)。

杀菌剂3种：33.5%喹啉铜悬浮剂(浙江海正化工股份有限公司)、80%硫磺水分散粒剂(印度伊克胜作物护理有限公司)、86.2%氧化亚铜可湿性粉剂(天津市绿亨化工有限公司)。

微肥：EDTA-Cu(乙二胺四乙酸铜钠，广州市快速路生物科技有限公司)。

1.1.3 供试作物 柑橘品种为“沃柑”。温室试验“沃柑”为1年树龄的健康植株，每2周浇一次霍格兰(Hoagland)溶液。田间试验“沃柑”为5年树龄的挂果健康植株。

1.2 试验方法

1.2.1 农业化学品对L1-21生长的影响 杀虫剂、杀菌剂按照中国农药信息网(http:∥www.chinapesticide.org.cn/)登记的浓度，EDTA-Cu按照产品包装推荐量，将固体LB培养基溶化适宜温度时，加入农业化学品，终浓度为田间登记使用浓度的0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和6.00倍，制作平板，以不加入农业化学品的为空白对照(CK)。将L1-21稀释至103CFU·mL-1，涂布于固体LB培养基上，37 ℃恒温培养8～10 h。4次重复。

1.2.2 农业化学品对L1-21在离体柑橘叶片定殖的影响 取室内1年树龄的“沃柑”植株当年生成熟叶片，选用4倍田间登记使用浓度的杀虫剂、杀菌剂和EDTA-Cu，分别与等量的L1-21-GFP菌株悬液(浓度为5×107CFU·mL-1)混合摇匀，使得农业化学品的终浓度为田间登记使用浓度的2倍，未加任何农业化学品的菌悬液(2.5×107CFU·mL-1)为对照(CK)。每个处理9个叶片，用50 mL的喷瓶均匀喷施于柑橘离体叶片正反两面，置于室温25～30 ℃环境下保湿24 h后，称1 g叶片于无菌操作台，以75%(v∶v)酒精消毒30 s，2.5%(有效氯)次氯酸钠消毒1 min，再用无菌水换洗3次，取最后的无菌水100 μL涂布于LB平板上，以无任何菌落长出为表面消毒彻底，以除去叶表微生物(郑雪芳等，2012)。用灭菌剪刀剪碎叶片后，置于无菌研钵内，加入9 mL无菌水研磨至匀浆。再以10倍梯度稀释法逐级稀释，不同梯度取100 μL稀释液均匀涂布于含Cm固体LB平板上，统计每个直径9 cm平板内长30～100个细菌菌落的结果，培养条件和样本数同1.2.1。在光电折射仪下记数荧光菌落数，以CFU·g-1表示。

1.2.3 农业化学品对柑橘活体叶片内生菌的影响 田间试验在云南省宾川县州城镇华侨社区四组柑橘园中进行，除供试的农业化学品外，整个试验期间不施用其他任何化学品。

于傍晚7点后，将5×107CFU·mL-1浓度的L1-21菌悬液均匀地喷施于叶片正反两面，24 h后，以前述10种化学品的田间2倍用量稀释液均匀喷施于柑橘叶片上，以叶片正反两面湿润不下滴为度。24 h后，每个处理取东南西北4个方向的成熟叶片总12片，检测其内L1-21和内生细菌总量。检测方法除培养基中未加抗生素Cm外，其他同1.2.2，统计品红色的菌落数量为L1-21的结果，细菌总数量为内生细菌总量的结果。各化学品均重复3次，以喷水为空白对照(CK)。

1.3 抑菌效果计算

各处理的抑菌效果均以菌落抑制率计算，用Excel 2007和DPS 7.05统计，以Duncan′s新复极差法比较各处理差异显著性。

抑制率/%=(对照菌落数量-处理菌落数量)/对照菌落数量×100

2 结果与分析

2.1 农业化学品在室内对L1-21菌株的抑制作用

2.1.1 杀虫剂 根据菌落数，6种杀虫剂对L1-21均具有显著抑制作用(表1)。吡虫啉、虫螨腈、甲氨基阿维菌素、噻虫嗪、辛硫磷0.25倍田间登记最高用量对L1-21有抑制作用，当用量达田间登记最高用量1倍时，L1-21被100%抑制，氟氯氰菊酯0.25倍的田间登记最高用量对L1-21的抑制率达100%，即这6种杀虫剂对柑橘内生菌L1-21有很强的抑制作用。

2.1.2 杀菌剂和微肥 根据菌落数，3种杀菌剂和微肥EDTA-Cu对L1-21均具有极显著抑制作用(表2)。按生产上推荐最高剂量来试验，喹啉铜402.00 mg·L-1、硫磺3728.00 mg·L-1、氧化亚铜620.60 mg·L-1、EDTA-Cu 1283.80 mg·L-1的抑制率都达100%，L1-21完全不能生长。

表1 6种杀虫剂对L1-21菌株的影响Table 1 Inhibitory effect of six pesticides on the endophyte L1-21

续表1

表2 杀菌剂和微肥EDTA-Cu对L1-21菌株的影响Table 2 Inhibitory effect of bactericides and the micro-nutrient fertilizer EDTA-Cu on the growth of the endophyte L1-21

2.2 农业化学品对离体柑橘叶片内L1-21菌株的影响

6种杀虫剂的田间登记使用量2倍药有效浓度的吡虫啉(112.00 mg·L-1)、虫螨腈(243.60 mg·L-1)、氟氯氰菊酯(91.02 mg·L-1)、甲氨基阿维菌素(8.00 mg·L-1)、噻虫嗪(100.00 mg·L-1)和辛硫磷(1600.00 mg·L-1)对L1-21的抑制率分别为76.13%、76.13%、81.16%、16.83%、85.80%、80.65%。除甲氨基阿维菌素8.00 mg·L-1的抑制率显著低于其他5种杀虫剂外，其他5种杀虫剂的抑制率均无显著差异。喹啉铜804.00 mg·L-1、硫磺7456.00 mg·L-1、氧化亚铜1241.20 mg·L-1和EDTA-Cu 2567.60 mg·L-1对L1-21的抑制率均高于80%，分别为83.50%、85.90%、86.42%、84.81%，且差异不显著(表3)，但所有化学品对离体叶片内的L1-21的抑制作用小于其直接对L1-21菌体的作用。

表3 农业化学品对离体柑橘叶片中L1-21菌株的抑制率Table 3 Inhibition rate caused by various agrochemicals to the growth of the endophyte L1-21 in detached citrus leaves

2.3 农业化学品对活体柑橘叶片内L1-21和内生菌总量的影响

6种杀虫剂田间登记用量的2倍剂量处理活体柑橘叶片后，24 h采样检测的结果表明，甲氨基阿维菌素8.00 mg·L-1对柑橘叶片内的L1-21抑制作用(抑制率4.23%)不明显，显著低于其他5种杀虫剂和3种杀菌剂与微肥EDTA-Cu，其他化学品的抑制率均达76.99%以上(表4)。对其他内生菌的抑制率以8.00 mg·L-1甲氨基阿维菌素最低，为6.78%，其他制品达46.90%～70.06%，且差异未达极显著水平。大田条件下，3种铜制剂和硫磺对柑橘内生菌的抑制作用明显高于6种杀虫剂的抑制作用(表5)。

表4 农业化学品对柑橘活体叶片中L1-21菌株的抑制率Table 4 Inhibitory effect of various agrochemicals on the growth of the endophyte L1-21 on live citrus leaves in the field

表5 农业化学品对田间柑橘叶片内生菌总量的影响Table 5 Inhibitory effect of agrochemicals on endophytes in live citrus leaves under field conditions

3 讨论

柑橘内生枯草芽孢杆菌L1-21具有防控柑橘黄龙病(专利号：201811266827.x)和溃疡病的潜力，有品红色菌落，易于辨别，用于培养基上检测农业化学品对柑橘内生菌的抑制作用，效果非常明了，同时作为指示菌有助于筛选出适于混合施用的化学品，为生产上应用提供依据。本研究结果证明，10种农业化学品的国家推荐用量对L1-21均有很强的抑制作用。但是，这些农业化学品在平板上的直接抑制作用大于对离体及活体叶片内L1-21的抑制作用，这可能与这些农业化学品在叶片上的渗透率和内吸性有关，而在培养基上是直接作用于菌体。这些化学品不仅对L1-21具有很强的抑制作用，而且能减少柑橘活体叶片内的内生菌总量，表明化学品的施用确实抑制了内生菌种群。

内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与寄主协同进化，在这一过程中形成了互利共生关系。感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗胁迫等优势，比未感染植株具有更强的生存竞争力(刘波等，2011)，如：内生菌Bacillushalotolerans能防治海枣枯萎病(Slamaetal.,2019)；Neotyphodium能进入禾本科植物内获得营养，但可减少寄主被草食动物伤害，提高植株耐旱、耐盐和抗除草剂能力(Gundeletal.,2008)；FusariumoxysporumFo47参与了抗病相关蛋白的积累，从而增加了番茄对枯萎病的抗性(Lamoetal.,2018)；Phialemoniuminflatum能减轻棉花线虫病的危害(Zhouetal.,2018)；棉花内生菌BacillusmethylotrophicusLH-L3被用来制作成种衣剂，包衣后可以减轻棉花黄萎病病情(陈丽华等，2018)；烟草内生菌被成功用于防治黑胫病(杨珍福等，2014)；Methylobacteria能减轻金属对番红花CrocussativusL.的毒性(Sánchez-Lópezetal.,2018)；Alternariatenuissima能减轻二沟黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge高浓度硒的毒害(Lindblometal.,2018)。而大量施入农业化学品在保障植物免受目标有害生物危害的同时，清除了内生菌，从而大大降低了植物的抗性作用，致使农业生产形成了化学依赖，或者以牺牲环境为代价，引起抗性害虫及病菌的产生。换言之，抗性害虫与病菌的产生也可能与大剂量地施入农业化学品清除了内生菌有关。为了避免这种化学依赖，必须选择环境友好、合适剂量的化学品，采用理性的施用技术，实现“双减”。

8.00 mg·L-1甲氨基阿维菌素对离体和活体柑橘叶片中L1-21抑制作用较小，对活体叶片中其他内生菌抑制作用也较小。离体和活体抑菌差异可能与各试剂进入叶片体内的能力存着差异有关，也可能与L1-21和柑橘体内其他内生菌对化学品的敏感性差异有关。除这1种杀虫剂抑制L1-21和其他内生菌能力稍弱外，其他9种农业化学品对内生菌都具有较强的抑制作用。因此，在施用农业化学品前，了解它们对内生菌的负面影响是非常必要的。即在化学品环境评价时，可以将其对植物微生态系统纳入评价体系内，从而确保植物内生菌系统不受负面影响。

本研究只是测定了农业化学品处理离体叶片和活体叶片24 h对柑橘内生菌的抑制作用，而内生菌是否在此后立即恢复原来群落结构或数量，及恢复期多长，还有待进一步研究。

铜制剂广泛用于柑橘溃疡病等细菌性病害防控，但是防效不长，致使该病目前大面积发生，是否与其广谱杀灭真菌、细菌，致使内生菌数量锐减有关值得深思。本研究不仅对于柑橘内生菌研究有重大意义，而且对其他植物微生态系统的研究同样起作积极作用。可以预料，随着人们对内生微生物系统认识的加深，滥用、乱用农业化学品的危害将会被深刻认识，正确使用化学品的重要性将会从微生态学角度得到关注。