表达TasA-n16N的枯草芽孢杆菌生物膜机械性能研究

秦思民 刘苏莹 诸 颖 吕 敏

1（中国科学院上海应用物理研究所中国科学院微观界面物理与探测重点实验室 上海 201800）

2（上海师范大学化学与材料科学学院 上海 200234）

3（中国科学院上海高等研究院基础交叉研究中心张江实验室 上海 201210）

4（中国科学院大学 北京 100049）

细菌生物膜（Bacterial biofilm）是由细菌聚集体及其分泌的多糖、蛋白质、核酸等生物大分子形成的相互黏附的胞外基质组成的类似膜结构的复合物。细菌几乎可以在所有天然或人造表面形成生物膜［1−2］。生物膜内部的细菌相互接触，特定的生物大分子相互作用，导致其表现出区别于自由悬浮细菌的独特理化性质。生物膜能保护内部细菌免受外界环境的干扰，例如其他菌种的入侵、温度的剧烈变化等，也让细菌逃避抗生素作用从而产生抗性［3−5］，极大地危害人类的健康和安全。因此，早期对生物膜的研究主要集中在如何彻底去除生物膜或者抑制生物膜的生长，其中研究最多的是条件致病菌铜绿假单胞菌［6−9］。近年来，随着人们对生物膜的深入研究，发现其对生产生活的正面作用，例如生物膜用于废水处理［10］或者微生物燃料电池制备［11］等。如何调控生物膜的结构性质使其更加有效发挥有利功能，成为生物合成领域的研究热点［12−13］。

合成生物学旨在对生物系统进行编程，以实现功能自定义化，即用DNA编码特定基因表达特定蛋白质或直接用蛋白质序列来指导从亚细胞水平到个体水平的行为。利用合成生物学手段，通过设计基因电路来调节生物体的基因表达，从而合成具有特定功能的生物材料。细菌由于基因组简单易改造，而生物膜又是细菌及其合成的一系列生物大分子的复合物，因此被广泛用到合成生物学领域，进行一些活体功能材料的合成［14−15］。Timothy 等［16］设计了一系列基因电路，实现了大肠杆菌生物膜中CsgA蛋白纤维的结构和功能的调节。Neel等［17］将一种人类细胞因子TFF2与大肠杆菌生物膜中的卷曲蛋白CsgA融合表达，体外成胶后，通过铸模将大肠杆菌生物膜做成了一种可降解生物塑料。Zhong等［18］则是用枯草芽孢杆菌表达了一系列基于生物膜卷曲蛋白TasA的融合蛋白，将生物膜改造成了活体功能材料合成平台；因为细菌保持活性，该平台表现出自我修复的能力；而生物膜适中的黏弹性则使其具有可3D打印的性质。

生物膜虽然已经被成功用于活体功能材料的合成，但是生物膜是粘弹性物质［19］，机械性能较差，严重地限制了其在可穿戴设备、建筑材料等方面的应用。因此，增强生物膜自身机械性能是拓宽其应用面的关键。

本工作选用生物安全性良好的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为模式生物，进行了TasA-n16N融合蛋白的表达，其中n16N为促进碳酸钙矿化的蛋白［20−21］，通过传统碳酸铵分解通入二氧化碳进行碳酸钙矿化的方法，将表达TasA-n16N 的生物膜制成形状规则的凝胶。借助同步辐射光源X射线透射显微镜等仪器表征生物膜的内部结构，并通过流变测试对比了表达TasA-n16N的生物膜经初步矿化形成凝胶前后的机械性能。本研究的结果为通过仿生矿化提高生物膜机械性能提供了新思路。

1 实验材料

1.1 主要仪器

Millipore Elix 5 型超纯水仪，美国Millipore 公司；高速离心机（5418），德国Eppendorf公司；TOMY SX-700 型高温高压灭菌锅，日本TOMY 公司；SHELLAB LI5-2 型恒温培养箱，美国SHELLAB 公司；LEO 1530VP 扫描电子显微镜，德国LEO 公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN 场发射透射电子显微镜，美国FEI公司；HYL-C小型组合式摇床，中国江苏省太仓市强文实验设备有限公司；MCR301流变仪，奥地利Anton Paar公司。

1.2 实验试剂

LB（Luria-Bertani）营养肉汤培养基粉末，去离子水，氯霉素，琼脂粉，3-（N-吗啉基）丙磺酸钠，丙三醇，L-谷氨酸钠，KH2PO4，K2HPO4，L-色氨酸，L-苯丙氨酸，盐酸硫胺，MgCl2·6H2O，CaCl2，FeCl3·6H2O，MnCl2，ZnCl2，酵母提取物，酪蛋白质氨基酸，葡萄糖，（NH4）2SO4，柠 檬 酸 钠，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，（NH4）2CO3。

1.3 质粒

TasA-n16N，质粒载体：pHT01，在枯草芽孢杆菌中表现出氯霉素抗性。酶切位点：5'XbaI，3'SmaI。TasA和n16N两种蛋白的氨基酸序列见表1。

表1 TasA和n16N两种蛋白的基因序列Table 1 Gene sequence of TasA and n16N

2 实验方法

2.1 溶液配制

2.1.1 培养基制备

LB抗性液体培养基：称取5 g LB营养肉汤培养基粉末，用200 mL 去离子水溶解，120 ℃高温灭菌20 min，冷却至室温，加入氯霉素，使其终浓度为10 μg∙mL−1，4 ℃保存备用。

LB抗性固体培养基：3 g琼脂粉加入200 mL LB液体培养基（未加抗生素）内，120 ℃高温灭菌20 min，冷却至50 ℃，加入氯霉素，使其终浓度为10 μg∙mL−1，倒入细菌培养皿，冷却凝固，4 ℃保存备用。

MSgg 抗性液体培养基（1 L）：23.125 g 3-（N-吗啉基）丙磺酸钠，5 mL 丙三醇，5 g L-谷氨酸钠，0.422 g KH2PO4，0.311 g K2HPO4，1 L去离子水溶液，pH调至7.2，120 ℃高温灭菌20 min，冷却至室温，加入1 mL氨基酸1 000×母液（0.5 g L-色氨酸，0.5 g L-苯丙氨酸，100 mL 去离子水溶解），1 mL 金属离子1 000×母液（40.66 g MgCl2·6H2O，7.768 6 g CaCl2，1.351 5 g FeCl3·6H2O，0.629 2 g MnCl2，0.013 6 g ZnCl2），100 μL 盐酸硫胺10 000×母液（0.674 5 g 盐酸硫胺，10 mL去离子水），最后加入氯霉素，使其终浓度为10 μg∙mL−1，4 ℃保存备用。

MSgg 抗性固体诱导表达培养基：3 g 琼脂粉加入200 mL MSgg 液体培养基（未加母液），120 ℃高温灭菌20 min，冷却至50 ℃，加入3 种母液及氯霉素，使其终浓度为10 μg∙mL−1，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其终浓度为1 mmol∙L−1，倒入细菌培养皿，冷却凝固，4 ℃保存备用。

2.1.2 质粒转化液制备

10×medium A base（100 mL）：1 g 酵母提取物，0.2 g酪蛋白质氨基酸，90 mL去离子水溶液，120 ℃高温灭菌20 min，加入10 mL 过滤除菌的50%葡萄糖，冷却后4 ℃保存备用。

10× medium B base（100 mL）：2 g（NH4）2SO4，13.97 g K2HPO4，6 g KH2PO4，1 g 柠檬酸钠，0.2 g MgSO4·7H2O，120 ℃高温灭菌20 min，冷却后4 ℃保存备用。

Medium A：4.05 mL 去 离 子 水，500 μL 10×medium A base，450 μL 10× medium B base，现配现用。

Medium B：4.95 mL Medium A，50 μL 金属离子溶液（50 mmol·L−1CaCl2·2H2O，250 mmol·L−1MgCl2·6H2O），现配现用。

2.2 生物膜培养

2.2.1 基因工程枯草芽孢杆菌制备

1）吸取2.5 μL野生型枯草芽孢杆菌30%甘油菌液，加入2 mL LB 无抗液体培养基中，37 ℃，220 r∙min−1过夜培养；

2）取上述菌液50 μL 于5 mL Medium A 中，37 ℃，220 r∙min−1培养4 h；

3）接500 μL A 菌 液 于5 mL Medium B 中，37 ℃，220 r∙min−1培养1.5 h，得到野生型枯草芽孢杆菌感受态细胞；

4）500 μL 感受态细胞中加入不超过3 μg 含TasA-n16N 片段的质粒，且质粒体积不超过感受态细胞悬液的1/20，37 ℃静置1 h；

5）37 ℃，220 r∙min−1培养2 h，去200 μL 菌液均匀涂于抗性LB固体培养基上，37 ℃恒温培养24 h；

6）挑取固体培养基上的单菌落于2 mL LB抗性液体培养基中，37 ℃，220 r∙min−1过夜培养，500 μL菌液加入500 μL 60%甘油溶液中，得到含有TasAn16N 质粒的工程枯草芽孢杆菌30% 甘油菌液，−80 ℃冻存备用。

2.2.2 TasA-n16N生物膜培养

1）接5 μL TasA-n16N枯草芽孢杆菌30%甘油菌液于20 mL LB 抗性液体培养基中，37 ℃，220 r∙min−1过夜培养；

2）过夜培养的菌液5 kg离心10 min，去除上清，MSgg抗性液体培养基重悬；

3）将重悬液滴在MSgg抗性固体诱导表达培养基上（每滴15 μL），在30 ℃恒温培养箱中培养3 d得到固相培养的生物膜。

2.3 块状生物膜凝胶制备及表征

1）将生物膜从固体培养基上刮下，转移至培养皿中，此时保存平行样品备用，其他样品加入CaCl2溶液，搅拌混匀形成匀浆；

2）将（NH4）2CO3粉末置于培养皿中，用封口膜封住，在封口膜上戳7个针孔；

3）将装有生物膜匀浆的培养皿与（NH4）2CO3培养皿放入大培养皿中，封口膜密封，20 ℃静置7 d；

4）取样，分别制样，用透射电子显微镜、扫描电子显微镜、同步辐射光源X 射线透射显微镜表征其内部结构；

5）将收集的生物膜样品与最后得到的凝胶样品进行流变学测试，对比其机械性能；

6）将形成块状生物膜凝胶转移至MSgg抗性固体诱导表达培养基上，30 ℃恒温培养72 h；在块状凝胶上取样接种于LB 抗性液体培养基，37 ℃，220 r∙min−1过夜培养。

3 结果与讨论

3.1 生物膜及块状凝胶的形貌结构

在MSgg 抗性固体诱导表达培养基上培养3 d后，Bacillus subtilis形成肉眼可见的形貌区别于普通单菌落的薄膜状结构，即生物膜；其面积比最初滴在培养基上的液滴面积稍有扩张（图1（a））。在转移收集过程中，固相培养的生物膜黏稠含水，粘附在培养皿底部（图1（b））。收集的生物膜与CaCl2溶液充分混合形成的匀浆（图1（c））在经过7 d的矿化后，形成了圆形块状凝胶（Block gel）（图1（d）），扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy，SEM）观察块状凝胶截面，看到其内部含有大量细菌（图1（e）），透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）（图1（f））和同步辐射光源X 射线透射显微镜（图1（g））观察到单个细菌形貌完整，周围还有TasA蛋白质组装形成的纤维结构，说明融合n16N蛋白质后，TasA蛋白质的功能未受到影响。

图1 固相培养生物膜及块状凝胶的表征(a)固相培养生物膜，(b)收集到皿里的生物膜，(c)生物膜CaCl2溶液形成的匀浆，(d)圆形块状凝胶block gel，(e~g)块状凝胶的SEM、TEM、同步辐射X射线透射显微成像Fig.1 Characterization of solid-phase cultured biofilm and block gel(a)Solid-phase cultured biofilm,(b)Biofilm collected in a dish,(c)Homogenates formed from biofilm CaCl2 solutions,(d)Block gel,images of(e)SEM,(f)TEM,(g)Synchrotron X-ray transmission microscope of block gel

3.2 生物膜及块状凝胶的机械性能

流变学测试结果显示，固相培养的生物膜的流变学性质与传统水凝胶性质类似，即其储存模量（G'）大于损耗模量（G''）；在应变破坏其结构后，G'下降，G''增大，并出现重合。块状凝胶的G'略有增大，说明机械性能增强。块状凝胶在5%应变下的频率扫描结果显示其G'小于G''，说明生物膜形成块状后结构发生变化，不再是传统水凝胶结构，而在扫描过程中出现了下降再上升的现象（图2（a））。为了排除偶然性，我们在1%和0.1%的应变下进行频率扫描，得到一致的结果（图2（b）），说明其结构在扫描过程中经历了被破坏再恢复的过程。在1 Hz 固定频率下的应变扫描结果显示，块状凝胶的两种模量都随着应变增强而下降，即其具有应变稀化性质。在应变小于1%时，其性质与生物膜性质类似，G'大于G''，应变超过1%时，G'小于G''，即结构性质发生变化，这个结果与频率扫描结果一致（图2（c））。综上所述，生物膜在形成块状凝胶后，结构发生变化，且机械性能提高。

图2 流变学性质测试(a)5%应变频率扫描，(b)1 Hz 应变扫描，(c)三种强度应变频率扫码Fig.2 Rheological test(a)Frequency sweep at 5%strain,(b)Strain sweep at 1 Hz,(c)Frequency sweep at three strains

3.3 块状凝胶内部细菌活性测试

细菌活体性质是活体功能材料与传统生物材料的最大不同。因此，在提高生物膜机械性能的同时，我们测试了其内部细菌的活性。图3（a）显示，形成的块状生物膜凝胶转移至MSgg抗性固体诱导表达培养基培养3 d 后，周围长出了新的褶皱，这说明生物膜经历结构破坏再重组后形成块状凝胶，在缺乏营养物质的过程中依然保持了再生功能。此外，块状凝胶内的细菌在LB 抗性液体培养基里过夜培养后，澄清的培养基出现了肉眼可见的浑浊（图3（b）），再次证明凝胶内细菌仍有活性。这些结果说明生物膜对于其内部细菌有很强的保护作用，为其被改造为活体功能材料提供了保障。

图3 块状生物膜内部细菌活性测试(a)块状生物膜周围长出褶皱状被膜，(b)块状生物膜内部细菌的活力Fig.3 The activity test of bacteria inside block biofilm(a)Formation of a wrinkled envelope around the block gel,(b)The growth of bacteria inside the block gel

4 结语

本研究中，我们选取枯草芽孢杆菌生物膜为模式生物，结合蛋白融合技术和传统碳酸钙矿化方法，研究了TasA-n16N融合蛋白的表达对该生物膜机械性能的影响。结果显示：n16N增强了生物膜对Ca2+的吸收，从而提高了生物膜的机械性能，却不影响生物膜的生物活性。这说明活体生物膜与无机矿物结合的仿生矿化可以有效调控生物膜的机械性能。而且，不同矿化层的性质不同，如碳酸钙硬度较高，磷酸钙的骨相容性较好，这为生物膜活体材料在建筑、骨修复和污水处理等领域提供了广阔的应用空间。

作者贡献声明秦思民：设计和完成所有实验，并分析数据和撰写文章；刘苏莹：提供TasA基因序列；诸颖：讨论和分析数据；吕敏：分析数据并撰写文章。