MMP-9及CD147在下咽癌中的表达及其临床意义

邹平 李华炎 周志华 何时知

下咽癌在临床中较常见，是一种头颈部恶性肿瘤，而且容易出现浸润生长，极易发生转移。一般情况下，当下咽癌患者确诊时，很多已发生淋巴结转移[1]。了解肿瘤对周围正常组织的侵袭，确定淋巴结是否转移，对确定肿瘤病情程度具有重要意义。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是一种Ⅳ型胶原酶，与肿瘤浸润、转移具有明显关系[2]。基质金属蛋白酶刺激因子CD147蛋白是一种高度糖基化单链跨膜糖蛋白，其相对分子质量在50×103～60×103，是免疫球蛋白超家族中的成员[3]。CD147在很多肿瘤患者中存在高表达，对肿瘤、浸润、转移具有促进作用[4]。本研究选取42例下咽癌患者，探讨MMP-9及CD147表达及其临床意义，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取佛山市高明区人民医院、北京同仁医院2018年8月-2020年4月42例下咽癌患者病理组织石蜡标本，设定为观察组，纳入标准：经病理组织检查确诊为下咽癌。排除标准：合并其他肿瘤。其中男36例，女6例；年龄45～70岁，平均（58.46±2.16）岁；TNM分期：T1期3例，T2期4例，T3期27例，T4期8例；病理分期：低分化鳞癌18例，中分化鳞癌13例，高分化鳞癌11例。选取同时期下咽癌切除时癌旁正常黏膜标本38例，设定为对照组，其中男31例，女7例；年龄45～71岁，平均（58.51±2.20）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 方法

两组均进行MMP-9、CD147表达情况检测。将组织标本通过超薄切片机进行切片处理，层厚为5 μm，每个组织均切3片，其中1片进行常规HE染色，其余2片分别作MMP-9、CD147抗体的免疫组织化学染色。

HE染色：将切片脱蜡，放置到苏木精染色液内进行浸泡，持续10 min，将其取出以水冲洗，去除多余染液。通过1%盐酸酒精进行浸提，在3次后实施分化，并用水冲洗，将多余盐酸酒精去除，通过流水对玻片进行浸洗，使之从淡紫色变成蓝色，之后将其放置到伊红染液内进行浸染，持续0.5 min，在沥干后，通过80%～95%无水酒精进行浸洗脱水，将其峰值到二甲苯溶液内予以透明处理，通过中性树脂进行封固后予以切片处理。

免疫组化染色：将切片进行脱蜡、水化，通过磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH 7.4）进行冲洗，重复3次，3 min/次。在实施微波修复抗原时，采用柠檬酸缓冲液，持续15 min。切片均加入3%过氧化氢溶液50 μl，通过室温孵育，持续10 min，以PBS进行冲洗，连续3次，5 min/次。将PBS液甩掉，切片分别放置 1∶100 MMP-9 一 抗 50 μl、1∶100 CD147 一 抗50 μl，在室温环境下孵育，持续60 min，通过PBS进行冲洗，反复3次，5 min/次。将PBS液甩除后，在切片上加入50 μl聚合物增强剂，在室温环境下孵育，持续20 min，采用PBS冲洗，反复3次，5 min/次。将 PBS液甩除，切片加入 50 μl二抗，在室温环境下孵育，持续20 min，经PBS冲洗，反复3次，3 min/次。将PBS液甩除，切片加入新配二氨基联苯胺（DAB）显色液100 μl，经显微镜观察3～5 min，棕色、红色时为阳性。采用蒸馏水冲洗，经苏木素复染，以0.1%盐酸分化，采用自来水冲洗，并以PBS冲洗，使之返蓝。通过梯度酒精进行脱水处理，干燥后，二甲苯透明，通过中性树胶完成封片处理。通过医用显微镜进行切片观察，且对下咽癌实施病理分级，并观察MMP-9、CD147阳性表达情况。

1.3 观察指标及评价标准

比较两组MMP-9、CD147的表达阳性率；比较观察组中 TNM 分期为 T1～T2与分期为 T3～T4MMP-9、CD147的表达阳性率。MMP-9、CD147的表达情况包括阴性（-）、阳性（+）、强阳性（++），表达阳性率=1-阴性率。采用HE染色切片进行诊断，经具有丰富经验的病理科医师进行读片证实；免疫组化染色切片通过计算机图文采集系统显微镜下进行观察，且对图像进行采集。MMP-9阳性通常处于细胞质，当肿瘤细胞中有棕黄色颗粒时，显示为阳性，CD147阳性通常处于细胞质、细胞膜，在肿瘤细胞膜有棕黄色颗粒时显示为阳性。按照显色强度与范围可将其分成：当阳性染色细胞率＜10%则为阴性（-）；当阳性染色细胞率为10%～50%或是染色浅时则为阳性（+）；当阳性染色细胞率＞50%及染色深时则为强阳性（++）。

比较观察组中有无淋巴结转移癌变组织中MMP-9、CD147的表达阳性率，包括+、++。

分析观察组中MMP-9、CD147的表达一致性，采用Kappa检验，MMP-9、CD147一致性为两个指标均显示的阴性、阳性、强阳性总和与总例数的比值。

1.4 统计学处理

研究数据采用SPSS 20.0录入处理，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，一致性采用Kappa检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组MMP-9、CD147表达阳性率比较

观察组MMP-9、CD147表达阳性率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组MMP-9、CD147表达阳性率比较[例（%）]

2.2 观察组不同TNM分期MMP-9、CD147的表达阳性率比较

分期为 T3～T4的 MMP-9、CD147表达阳性率高于T1～T2，但比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 观察组中不同TNM分期MMP-9、CD147的表达阳性率比较[例（%）]

2.3 观察组有无淋巴结转移癌变组织中MMP-9、CD147的表达阳性率比较

观察组中有淋巴结转移患者35例，无淋巴结转移者7例。淋巴结转移患者中MMP-9、CD147表达阳性率高于无淋巴结转移，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。

表3 观察组有无淋巴结转移癌变组织中MMP-9、CD147的表达阳性率比较[例（%）]

2.4 观察组MMP-9与CD147表达一致性

观察组中MMP-9、CD147表达同时为阴性11例，阳性13例，强阳性14例，一致率为90.48%（38/42），Kappa值为0.663，见表4。

表4 观察组MMP-9与CD147表达一致性（例）

3 讨论

肿瘤发生、发展的过程涉及多个因素的参与，而且是通过多个步骤完成的，而肿瘤的侵袭、转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，也是导致肿瘤存在较高治疗难度的重要因素。机体中，细胞外基质和肿瘤转移存在较明显关系，肿瘤细胞、周围细胞外基质间往往出现一系列动态改变，在此过程中，往往存在较多酶释放，且导致细胞外基质成分发生降解，致使肿瘤细胞发生侵袭、转移。其中CD147、MMP-9发挥了重要作用。CD147分布较广泛，在机体正常组织的角质细胞、胚胎上皮细胞、血管内皮细胞等部位存在，可参与到机体血脑屏障的构成中，且在创伤愈合、组织修复、妊娠与胚胎发育等生理过程中具有一定表达，而非造血组织、肿瘤组织内也可能出现一定表达，且对诱导肿瘤组织恶性潜能等发挥了重要作用，与肿瘤浸润、转移具有明显关系[5]。CD147在细胞间、细胞与基质进行黏附中具有较高参与性，而且在肿瘤表达中可对相邻癌细胞产生作用[6]。MMP-9对基底膜Ⅳ型胶原酶等基质成分具有明显降解作用，去表达与肿瘤浸润、转移具有明显关系。

经研究可知，观察组MMP-9、CD147表达阳性率均高于对照组，观察组TNM分期为T3～T4的MMP-9、CD147 表达阳性率高于 T1～T2，差异无统计学意义（P＞0.05）；淋巴结转移患者MMP-9、CD147表达阳性率高于无淋巴结转移（P＜0.05），MMP-9、CD147表达一致率为90.48%，Kappa值为0.663。由此可知，在健康组织细胞中，MMP-9、CD147无较高的表达，而肿瘤会导致MMP-9、CD147表达明显上升，当肿瘤出现淋巴结转移时，会导致MMP-9、CD147出现明显表达。患者肿瘤分期高时，MMP-9、CD147表达阳性更高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。MMP-9、CD147在对肿瘤进行检测时，其结果具有较高的一致性。通常认为，肿瘤细胞表面CD-147分子对MMP-9具有一定的刺激与激活能力，从而对癌细胞侵袭与转移具有促进作用。在正常情况下，下咽处组织中并未出现MMP-9表达情况，有的会表现为弱阳性表达，但是下咽癌细胞往往出现MMP-9的强阳性表达，通常聚集于细胞质[7]。CD147在正常下咽处组织内无表达，或可于黏膜基底层细胞呈现弱阳性表达，但肿瘤细胞细胞质、细胞膜均表现出强阳性表达。当患者肿瘤分期增加时，并不会导致MMP-9、CD147表达上升，因此其对病情严重程度无较明显反映。但是，当肿瘤发生淋巴结转移时，MMP-9、CD147往往出现较明显表达，因此，可有效评估肿瘤是否发生转移[8]。

MMP-9在肿瘤侵袭转移中发挥了重要作用，主要包括，（1）可消除屏障：MMP-9可消除细胞外基质（ECM）屏障，有利于肿瘤侵袭转移[9]。（2）影响细胞间黏附：肿瘤细胞为了侵袭转移，需抵抗细胞间、细胞与基质的黏附。通过胰蛋白酶产生作用，可使细胞壁上生长的细胞有效脱落，而MMP-9是肿瘤侵袭转移中较常见的一种蛋白质水解酶。（3）新生血管形成：肿瘤在生长、转移中，需要大量新生血管，MMP-9在一定程度上对血管形成具有明显作用。在ECM降解中，新生血管可获得较多空间，基质可释放一些利于血管形成的因子。MMP-9可使肿瘤更快速生长，可促进毛细血管末梢形成，对血管内皮基底膜具有重要作用。肿瘤内炎性细胞大量分泌MMP-9，利于血管内皮生长因子（VEGF）能够有效结合VEGF受体，可使肿瘤新血管大量增加。CD147对癌细胞扩散转移具有重要作用，（1）细胞间黏附：对基质金属蛋白酶（MMPs）水平、活性进行改变，导致组织屏障受损，肿瘤细胞发生侵袭转移[10]。（2）细胞、基质黏附：可结合α3β1，与基质蛋白产生作用，对基质成分进行有效降解，致使肿瘤细胞更快速地进行侵袭转移[11]。（3）在细胞内羧基端结构变化、结合基质蛋白作用下，促进基质成分有效降解，可使肿瘤细胞出现扩散转移[12]。肿瘤细胞内表达的CD147分子能够对相邻癌细胞进行作用，通过相互诱导可使MMPs大量释放降解基质，对于肿瘤浸润、转移具有明显促进作用。

综上所述，MMP-9及CD147的表达可对下咽癌病情进行有效反映，对治疗下咽癌具有重要指导意义。