氟化钠壳聚糖凝胶对乳牙釉质抗酸能力的影响

邱赛男，臧睿觉，梅予峰，张晓旻，曹 灵，周红艳

Stomatology,2022,42(1):68-71，91

儿童因饮食习惯及有限的口腔卫生清洁能力，乳牙龋病高发，氟化物的使用可以有效地控制龋病的发展。pH值较低的酸会造成牙釉质的釉柱本身及釉柱间隙的脱矿溶解，酸持续作用会造成牙齿表面的溶解伴发釉质的软化，并最终造成结构缺损。本实验首先配制氟化钠壳聚糖凝胶，观察其基本性能；然后使用氟离子选择电极检测壳聚糖氟化钠凝胶氟离子的释放速率；最后比较氟化钠壳聚糖凝胶及其他药物预处理后的乳牙釉质试件在酸蚀后的脱出钙离子浓度，探讨氟化钠壳聚糖凝胶的抗酸能力。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年9月—12月于南京医科大学附属口腔医院儿童口腔科拔除的乳前牙28颗(已征得患儿及家长同意)。要求乳前牙没有龋坏，磨耗量适中保证唇面釉质的面积大小，釉质表面没有裂纹，拔除时注意不要用力过猛，造成不必要的裂纹。

1.2 仪器与试剂

配制氟化钠壳聚糖凝胶及检测所需：壳聚糖(Sigma 448877)，氟化钠(AR，无锡亚盛化工)，盐酸(AR，上海凌峰化学试剂有限公司)，β-甘油磷酸钠(AR，sigma)，总离子强度缓冲液Ⅱ(TISAB Ⅱ，南京医科大学公共卫生实验室提供)，去离子水。大型磁力搅拌仪(国华)，制冰机(三洋)，DD-2B电极电位仪(江苏姜堰市光大仪器厂)，pH仪(FiveEasy)，烧杯。

试件釉质处理和抗酸实验所需：乳酸(AR，沪试)，抗酸指甲油(美宝莲)，原子吸收分光光度计(德国耶拿，AAS vario 6型)。

1.3 配制5%氟化钠壳聚糖凝胶及性能测定

制备0.05 mol/L的盐酸100 mL，放入壳聚糖，室温搅拌24 h，制备出饱和的壳聚糖盐酸溶液。使用离心机，去除多余的壳聚糖粉末，保留上清。将壳聚糖上清液置于广口瓶中，高压蒸汽灭菌30 min，静置冷却到常温，放入4 ℃冰箱备用。pH仪测定壳聚糖盐酸溶液的pH值，去离子水配制56%(质量浓度)的β-甘油磷酸钠溶液。

取2 mL壳聚糖盐酸溶液，加入0.189 4 g NaF(参考多乐氟5%NaF浓度配制)，逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液1.2 mL，在冰水浴下搅拌均匀，配制成5%(质量分数)的壳聚糖氟化钠凝胶。

肉眼观察其颜色、质地、性状等，倒置实验观察其流动性，pH仪测定壳聚糖氟化钠凝胶的pH值。

1.4 氟化钠壳聚糖凝胶释氟速率检测

精确称取4.2 g NaF，与100 mL去离子水混合，配制0.1 mol/L的标准氟化钠溶液，使用TISAB Ⅱ缓冲，甘汞氟离子选择电极测定，获取氟离子浓度标准曲线。

制备三份壳聚糖氟化钠凝胶样本，甘汞氟离子选择电极测定出氟离子的释放浓度。

1.5 釉质抗酸实验

1.5.1 釉质试件准备 拔出的乳前牙，用金刚砂平颈缘去除牙根，橡皮轮抛光釉质表面，三用枪冲洗表面30 s后，置于去离子水中，4 ℃冰箱保存。存放24 h后，取出乳前牙，使用低速切割机纵向切除部分舌侧硬组织，留约3 mm厚唇侧硬组织片。试件唇侧釉质中央预留3 mm×3 mm的实验区域，其余部分用抗酸指甲油涂3遍，待指甲油干燥后，置于去离子水中，4 ℃冰箱保存。

1.5.2 试件釉质处理 试件随机分成4组，每组7片，用吸水纸吸干试件表面的水分。三组在实验区分别均匀地涂上氟化钠壳聚糖凝胶、壳聚糖空白凝胶、多乐氟，另一组不作处理作为空白对照。各组釉质片在经历了5 min的酸蚀处理后，以Ekstrand增强肉眼光学检查视诊等级计分标准(表1)评定。

表1 Ekstrand增强肉眼光学检查视诊等级计分标准

上药处理后，样本置于烧杯中，加入去离子水，保持整体的湿润环境，并放入37 ℃恒温箱中4 h。取出各组试件，用尖刀片轻柔去除表面附着的药物，用三用枪冲洗试件30 s，置于去离子水中备用。

1.5.3 釉质抗酸实验 配制0.1 mol/L的乳酸溶液，常温测定pH值为4.0。每一组的试件分别浸泡于5 mL 0.1 mol/L乳酸溶液，酸蚀5 min，取出试件，用3 mL去离子水冲洗，收集各样本的酸蚀溶液和冲洗液8 mL。溶液进行火焰原子吸收分光光度法检测溶液中钙离子的浓度。

1.6 统计学处理

各组数值录入SPSS19.0统计分析，不同组的钙离子浓度进行方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 壳聚糖氟化钠凝胶基本性能

壳聚糖氟化钠凝胶常温下呈淡黄色粘稠清亮液体，pH=6.98。放置在37 ℃恒温箱内，3 min初步凝固，10 min后从恒温箱内取出，呈软白色果冻状凝胶，质软(图1)。

左侧为壳聚糖氟化钠凝胶常温下保存；右侧为壳聚糖氟化钠凝胶经10 min 37 ℃恒温箱保存

2.2 壳聚糖氟化钠凝胶释放率

氟化钠标准液经氟离子选择电极测定氟离子标准曲线函数为y=41.143x-66.667(x轴Ig浓度，y轴为氟离子选择电极的测定值)；线性相关指数R2=0.934 5(图2)。

图2 氟离子标准曲线图

2.3 不同组釉质试件酸蚀后使用Ekstrand增强肉眼光学检查视诊等级计分

图3 壳聚糖氟化钠凝胶释放曲线

各组吹干5 s后发现不透明的斑块，均为1级计分，潮湿牙面无明显异常，其中壳聚糖空白凝胶组和空白对照组表现的色泽较壳聚糖氟化钠凝胶组及多乐氟组要更白，通透性更差。

2.4 不同组釉质试件乳酸溶液中钙离子浓度比较

氟化钠壳聚糖凝胶、壳聚糖空白凝胶、多乐氟、对照组钙离子浓度分别为(4.29±0.65)、(7.20±0.88)、(4.22±0.34)、(7.34±1.41)mg/L。氟化钠壳聚糖凝胶组与多乐氟组没有统计学差异(P>0.05)，与壳聚糖空白凝胶组及空白对照组有统计学差异(P<0.05)，且钙离子浓度低于壳聚糖空白凝胶组及空白对照组。

3 讨 论

氟化物是公认的防龋药物之一，从20世纪初就已经开始进行应用，具有降低釉质溶解度和促进釉质再矿化、影响致龋细菌代谢、改变牙齿萌出后的形态和结构的特点，从而具有防龋的功效[1]。含氟产品的使用可以是患者进行的自我保健方法，也可以是专业的口腔医生给予的专业预防操作保健。对于儿童来说，使用含氟牙膏的量及含氟漱口水的用量控制尤为重要，因为儿童的含漱能力和吞咽的配合能力有限，过量氟化物的使用，会引起儿童的中毒反应。所以临床上对儿童用氟的指导理念是小于4岁的不宜局部用氟，也不推荐使用含氟牙膏及含氟漱口水，而是由临床医生进行含氟涂料或凝胶的涂布操作。

Chau等[2]证实，氟化物可以抑制细菌生物膜的形成，且其活性与时间有一定的相关性。其在用量和次数上有更多的限制，这样对于控制氟的过量摄入有很好的保证。涂料在操作方式和方法上和凝胶有相似之处，都需要保持釉质的干燥，在药物涂布完后一定时间内不喝水不吃东西，从操作的简便性上看，并不是很复杂的操作。不过操作的难度和儿童对命令以及行为控制的配合程度有关[3]。

欧洲儿科牙科学会(EAPD)发布的氟化物应用指南[4]指出儿童含氟凝胶较涂料的操作要更简单，清洁完牙面只需患者佩戴牙合垫轻咬几分钟即可，操作的用量仍需要严格控制。多乐氟的出现，使得操作更为简便，涂在釉质表面的多乐氟在遇到唾液后可以硬化，只要控制儿童4 h不进食饮水，唾液不下咽即可。

但多乐氟凝胶成本相对较贵，用壳聚糖水凝胶作为一种凝胶载体，它的原料壳聚糖是自然界中的第二大多糖甲壳素的脱乙酰基产物，来源丰富制取便宜，其价格便宜，同时Arnaud等[5]指出单纯的壳聚糖溶液也有保护牙釉质、抵抗酸蚀的作用。

制作壳聚糖水凝胶的过程并不复杂，完成的凝胶为智能型凝胶，温度升高凝胶由液相向胶体相转变，这对于凝胶的保存以及使用时的方便程度都有很好的指导意义。臧圣奇等[6]的实验通过对壳聚糖温敏凝胶的凝胶时间、黏度、溶胀率、降解率、微观结构等方面的研究，肯定了壳聚糖凝胶作为组织工程支架，复合细胞、药物、蛋白的利用价值。

壳聚糖氟化钠凝胶的pH值接近中性，对药物和人体组织的损害较小，生物相容性较好。作为大分子多糖，壳聚糖氟化钠凝胶提供的空间可以作为药物的良好载体。近年来多乐氟作为口腔局部用药的经典药物，常作为评估其他药物氟离子释放率的参考标准，经我们研究发现氟化钠壳聚糖凝胶组与多乐氟组4 h氟离子释放率没有统计学差异。Ruel-Gariépy等[7-9]的研究证明，壳聚糖温敏凝胶作为药物的载体，其释放速率与药物的分子量有关，药物分子量越大，释放速率越慢，本实验中氟化钠作为小分子亲水药物4 h释放70%是可以接受的。同时Keegan等[10]制作的壳聚糖纳米喷雾搭载氟化钠，其最大搭载药物量达到14%的氟化钠含量，释放率达到84.1%，证明了壳聚糖作为氟化钠搭载载体的能力。因此本课题设计制作的壳聚糖氟化钠凝胶是成功的，搭载了高浓度的氟化钠，并且很好地控制了药物的pH值，其药物的释放率也符合壳聚糖温敏水凝胶的一般特性。

釉质的早期龋坏即为釉质表面在细菌代谢产物的酸蚀作用下出现的表面矿物质析出，呈现出白垩色的色泽变化，白垩色越不明显说明其脱矿情况越低。经由Ekstrand增强肉眼光学检查视诊等级计分标准[11]评定，各组都表现为釉质脱矿集中在釉质外层1/2，类似于临床上见到的釉质脱矿的早期龋坏。氟化钠壳聚糖凝胶及多乐氟处理过的试件，在肉眼观察其白垩色时，无单纯壳聚糖水凝胶和未处理组明显。Torlakovic等[12]的研究结果说明早期龋的白色病损，其病变程度和白垩色深度呈正相关的，本实验的肉眼观察结果说明氟化钠壳聚糖凝胶及多乐氟抑制酸蚀的能力优于壳聚糖空白凝胶及空白对照组。

釉质表面的酸蚀液进行钙离子浓度的检测，是一种经典的定量检测方法Grenby[13]早在1996年釉质检测方法的综述中就有详细的描述，可以有效量化釉质表面脱矿的程度。而且这种方法在体内体外都可以进行。Young等[14]验指出釉质的化学检测在体内试验中需要绝对的隔绝唾液，以防止影响检测结果，而体外实验的操作更加准确简便。从我们的结果可知，实验各组在酸蚀过程中脱出的钙离子浓度是有区别的。组间的比较氟化钠壳聚糖凝胶与多乐氟处理组析出的钙离子浓度数值无差异，壳聚糖空白水凝胶与空白组无差异，同时氟化钠壳聚糖凝胶、多乐氟析出的钙离子浓度要远低于壳聚糖空白水凝胶及空白组。这说明，氟化钠壳聚糖凝胶及多乐氟抗酸的效果优于壳聚糖空白水凝胶，并且效果相似，这与肉眼观察到的结果相同，说明了氟化钠壳聚糖凝胶与多乐氟的抗酸蚀效果。

多乐氟作为防龋处理的金标准，一直被临床广泛应用，其pH值为4.5[15]，Magalhães等[16]进行的TiF4和NaF涂料的实验，指出釉质表面在各种药物处理后，最高可以持续抵抗酸蚀30 min。同时Arnaud的实验[5]报道，壳聚糖溶液涂抹在釉质表面产生的抗酸效果是壳聚糖本身渗透入釉质层产生抗酸效果与本研究所提及的氟化钠壳聚糖凝胶抗酸原理不同，本研究中的氟化钠壳聚糖凝胶与壳聚糖空白凝胶的抗酸效果有统计学差异，且氟化钠壳聚糖凝胶抗酸性能更好，这一效果提示其抗酸效果来自氟化物。

釉质的检测方法有其多样性，主要分为定量检测和定性检测[17]。SEM和EDS的联合使用，使定性和定量的研究很好地结合在一起。在抗酸蚀的过程中，肉眼对于釉质表面的变化的观察，在临床应用中起到大致的指导性说明作用。乳牙牙釉质薄，平均约1 mm左右，打磨抛光制成标准试件则表面的釉质层可能已经剥脱，所以选用化学检测这一经典方法，可以更明确地指出氟化钠壳聚糖凝胶抗酸蚀的能力。

Rölla、Saunders等[18-19]的实验证实，氟化物具有保护牙体硬组织免于酸蚀伤害的作用，虽然也有文献指出氟化物的保护作用有限[20]，但大多数的文献支持的结论与我们研究的结果相似，壳聚糖凝胶作为载体很好地使氟化物与釉质接触和反应，氟化钠壳聚糖凝胶具有4 h的持续释放能力，持续高浓度的氟化钠提高了釉质的抗酸蚀能力。

氟化钠壳聚糖凝胶处理后的乳前牙釉质，与金标准的多乐氟达到了一致的抗酸能力；所以氟化钠壳聚糖凝胶有望作为防治乳牙早期龋的药物，并应用于临床。