基于CRISPR建立“精确引导的昆虫不育技术”平台大幅提高致死效率

斑翅果蝇是一种入侵世界诸多地区的作物害虫，对水果生产造成了重大的农业和经济损失。斑翅果蝇将卵深深地产在不腐烂的成熟果实的软肉中，导致果实损坏，且限制了喷雾式杀虫剂的有效性。樱桃、覆盆子、黑莓、蓝莓、草莓、桃子、李子、油桃、葡萄，橄榄、西红柿、猕猴桃、无花果和苹果都被发现受其危害。2008年，在美国加利福尼亚州、俄勒冈州和华盛顿州，斑翅果蝇导致的损失估计50亿美元。

目前用于抑制斑翅果蝇种群的主要方式是杀虫剂。然而，越来越多的证据表明，斑翅果蝇正在对杀虫剂产生有可能广泛的抗药性。考虑到这些非特异性广谱杀虫剂对环境的影响，寻找环境友好的害虫管理方法十分必要。

近日，加州大学圣地亚哥分校的研究人员将基于CRISPR的新技术应用在了斑翅果蝇的控制上。

该校生物科学学院细胞与发育生物学系教授阿卡巴里和肯多尔等其他研究人员于2019年首次在普通果蝇中展示了“精确引导的昆虫不育技术”。该方法使用可编程的CRISPR技术来编辑控制昆虫性别决定和生育能力的关键基因，后来也被证明适用于蚊子。

阿卡巴里共同创立了生物技术公司Agragene，该公司已从加州大学Riverside分校（Akbari最初领导该技术的开发）获得了pgSIT基础技术许可，并正在实施由美国农业部管理的pgSIT田间试验。该公司希望这些试验能够证明pgSIT的安全性和有效性，并能通过监管部门批准，以在农业上广泛应用。

pgSIT开发的昆虫卵被部署到目标种群中，只有不育的雄性昆虫才能孵化；不育雄性交配后产生的后代不育，从而达到抑制种群数量的目标。

“这是一个安全、进化稳定的系统。”阿卡巴里说，“此外，该系统不会导致不受控制的传播，也不会在环境中持续存在——这两项重要的安全保障都将有助于其获得使用批准。”

昆虫不育技术（SIT）已经使用了半个多世纪。而其背后的概念可以追溯到20世纪30年代，当时农民找到了将不育雄性释放到田间以减少害虫的方法。到本世纪中叶，美国农民开始使用紫外线辐射对螺旋锥蝇进行不育诱导。

SIT一般通过反复释放绝育的雄性昆虫来抑制种群，这些不育的雄性将与野生雄性竞争，以与野生雌性交配。为了有效地利用昆虫不育技术，理想的解决方案是：（1）大规模饲养昆虫，（2）对雌性进行有效的遗传选择，（3）确保雄性不育，（4）培育具备环境适应力和性竞争力的雄性，（5）具有成本效益的运输和部署、田间投放措施。

传统SIT利用DNA损伤（如紫外线辐射）来产生绝育雄性，因此需要按照较大的雄/雌比例释放雄性才能抑制当地种群。

而阿卡巴里之前通过普通果蝇和埃及伊蚊开发的基于下一代昆虫不育技术的方法，称为“精确引导昆虫不育技术（pgSIT）”，利用CRISPR/Cas9技术对导致雌性致死性和雄性不育的特定基因突变位点进行编程诱导。

如上图所示，图A展示了经典SIT依靠辐射对蛹或成年苍蝇进行绝育，然后去除其中雌性，释放雄性。结果，在环境中释放的每只雄性都以一倍的比例规模进行饲养、绝育和性别分类。

SIT和pgSIT的比较

而在pgSIT中，如图B所示，含有Cas9和gRNA的亲本之间进行杂交，靶向对雌性生存能力和雄性生育能力至关重要的基因导，从而导致靶向基因的破坏，以达到雌性致死和子代中的雄性不育。每个亲本雌性可以产生多达300个后代，其中50%将是绝育的雄性，也就是每个雌性产生150个不育雄性。

这使得pgSIT潜在的扩展优势为150倍。此外，传统的SIT需要处理和释放成年雄性，人工操作大大提高了其成本。而使用pgSIT，卵可以直接在环境中部署和孵化，从而消除了手动释放不育雄性的需求。

而在该研究中，他们设计了一个针对斑翅果蝇的pgSIT系统，可用于产生有竞争力的不育雄性。正如所设想的那样，经过pgSIT处理的卵可以在实验室生产，在被害虫入侵的地点释放。大约两周后，只有不育的雄性才会孵化。由于只有两个基因被敲除，雄性显得足够健康，可以与野生雄性进行竞争，并迅速寻找雌性交配，从而产生不可育的后代。

值得注意的是，在某些株系中，其pgSIT 技术可以产生高达100%的不育雄性，所有雌性都死亡或转化为双性。不过，尽管有这些显著的结果，并非所有都完美，这可能取决于多种因素，包括Cas9的maternal deposition和其他未开发的因素，例如转基因插入位置和/或gRNA靶序列。鉴于这些结果，有可能通过靶向其他基因来进一步改善该系统。

“这项技术将取代对杀虫剂的需求”阿卡巴里说，“在过去的四年里，我们为几个不同的物种开发了 pgSIT。展望未来，我们希望将其用作平台技术，可以移植到各种害虫中去，以安全地解决现实世界的问题。”