不同年限不同部位霍山石斛多酚含量差异

邓 辉，刘莉彬，陈文正，郭 歌，黄金龙，祝启张，刘庆慧，乔德亮

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.皖西学院 安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

0 引言

霍山石斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tanget S.J.Cheng)俗称“米斛”“龙头凤尾草”，是兰科石斛属的草本植物，是中国国家地理标志产品[1]。原产地是安徽省六安市的霍山县，适宜生长在半阴性、温暖、潮湿的地方。石斛为中国特有，其中霍山石斛品质最佳，属于国家一级野生保护植物，其茎可入药，也可以泡茶、煲汤、浸酒食用，咀嚼后口感粘滞感较强。

植物多酚是在植物体内发现的化合物，是一种人们日常生活中所需的重要物质，主要存在于植物的果实和根、茎、叶中，对人体健康具有增强和促进作用。多酚可以起到抗氧化作用，对氧化损伤具有抵抗和抑制功能，长期食用可对一些慢性病，比如心血管疾病、癌症和衰老有着预防作用[2]。多酚因具有广泛的抗氧化、抗癌、抗炎和抗辐射等作用，受到食品、工业生产、医药研究等领域的青睐[3]。多酚的提取与利用对人体健康有着很重要的作用。研究表明，霍山石斛含有多酚、多糖、生物碱等有效成分[4-6]，能有效提高机体的免疫功能，对人体体内的一些器官(比如眼、胃、肾等)和血液有着特殊治疗效果。霍山石斛多酚还具有抗肿瘤、抗白内障、护肝、延缓衰老和抗突变的作用[7]。

随着人们对生活质量要求的提高，越来越多的人注重身体健康和疾病防护，霍山石斛开始进入人们的视野。但是霍山石斛对环境要求苛刻，产量稀少，以至于供不应求，甚至到了灭绝的边缘。多酚含量的测定对于霍山石斛培养栽植有着重要意义，所以研究不同年限、不同部位霍山石斛酚含量的测定，为不同年限、不同部位霍山石斛的药用价值研究提供基础数据。试验采用薄层层析法进行鉴别，薄层层析法操作简单，反应灵敏，能够准确、快速地得到实验结果[8]。根据2019年谢景宇等[9]利用薄层层析法对野艾蒿中双四氢呋喃类木脂素的抑菌活性研究以及2020年施海珊等[10]以薄层层析法对雄烯二酮的定性检测可知：薄层层析法可以很好地鉴别石斛中多酚的成分差异。用紫外线分光光度计法能够快速、准确地分析物质的成分和含量[11]，因此本实验用紫外线分光光度计法来测量霍山石斛多酚的吸光度。

1 材料和方法

1.1 实验原料

霍山石斛(一年生霍山石斛、两年生霍山石斛和三年生霍山石斛，均来自皖西学院霍山石斛标准化种植示范基地，采摘时间为冬至时节，品种经过皖西学院陈乃富教授鉴定)

1.2 仪器与试剂

(1)主要仪器：紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司生产)、FA-1004型电子天平(上海精科天平厂生产)、索式提取器、层析缸、HH-4数显恒温水浴(金坛市国华电器有限公司生产)。

(2)主要试剂：无水乙醇、无水三氯化铁、硅胶板、甲苯、没食子酸分析对照品、乙酸乙酯、无水碳酸钠、甲酸、没食子酸标准品、福林酚试剂(以上试剂均为分析纯，天津博迪化工股份有限公司生产)。

1.3 实验方法

将挑选出的霍山石斛根、茎、叶放在80 ℃烘干箱中干燥至恒重，取出后粉碎，用20目筛过筛得到若干种石斛粉末，一年生霍山石斛粉末(根、茎、叶)标记为A，两年生霍山石斛粉末(根、茎、叶)标记为B，三年生霍山石斛粉末(根、茎)标记为C，三年生霍山石斛没有叶片。

1.3.1 霍山石斛多酚的提取

分别精密称取若干种霍山石斛粉末(根、茎、叶)0.5 g，放于100 mL烧瓶中，同时按料液比1：20(g·mL-1)加入一定量的80%乙醇，粉末溶解一段时间后安置好索式提取器，温度控制在80 ℃，通过冷凝回流提取方式提取3次，提取时间为1 h。将提取好的溶液放置于烧杯中，在温度80 ℃以上的恒温水浴锅内蒸发剩余乙醇，倒入150 mL容量瓶中定容即得霍山石斛多酚提取溶液。将一年生霍山石斛根、茎、叶多酚提取液分别标记A1、A2、A3，两年生霍山石斛根、茎、叶多酚提取液分别标记B1、B2、B3，三年生霍山石斛根、茎多酚提取液分别标记C1、C2。

1.3.2 没食子酸标准曲线的制备

用电子天平准确称取0.0110 g没食子酸标准品，放入100 mL容量瓶中用蒸馏水溶解定容，配置成质量浓度为0.11 mg·mL-1的没食子酸标准溶液。依次取没食子酸标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 并置于25 mL的棕色容量瓶中，加入福林酚试剂0.5 mL，混匀；在4～8 min内加入20%的Na2CO3溶液1.5 mL，充分摇匀并定容；在黑暗中反应30 min，在517 nm处测定吸光度A，做三组平行实验。以纵坐标y为吸光度值，横坐标x为多酚浓度，绘制没食子酸的多酚标准曲线。

1.3.3 霍山石斛多酚的含量测定

分别从霍山石斛多酚提取液A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2中取1.0 mL，以蒸馏水1.0 mL作为空白对照，加入福林酚试剂0.5 mL，混匀；在4～8 min内加入20%的Na2CO3溶液1.5 mL，充分摇匀并定容；在黑暗中反应30 min，在517 nm处测定吸光度A。将测定的不同吸光度代入没食子酸标准曲线中，计算出不同年限霍山石斛根、茎、叶的多酚含量。

1.3.4 霍山石斛多酚的色谱鉴别

取少量上述不同年限、不同部位霍山石斛的多酚提取液备用。定量称取没食子酸标准品，按照每1 mL含0.5 mg的没食子酸标准品要求加入80%乙醇溶液作为对照品。用毛细管分别吸取上述不同溶液点于硅胶板上，要求控制原点大小一致。用甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6：3：1)为展开剂，放入层析缸中，展开，取出，晾干，喷1%三氯化铁乙醇溶液，根据显示出的图像分析色谱。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱分析

实验分为三组，按照不同年限霍山石斛根、茎、叶分别和没食子酸对照品作为一组点样，在硅胶板上进行差异分析，根据色谱上斑点的有无、斑点的大小和斑点颜色的深浅来比较含量差异。

图1 不同年限霍山石斛根的多酚层析谱 图2 不同年限霍山石斛叶的多酚层析谱 图3 不同年限霍山石斛茎的多酚层析谱

图中M1代表没食子酸对照品，M2表示一年生霍山石斛根，M3表示两年生霍山石斛根，M4表示三年生霍山石斛根，M5表示一年生霍山石斛叶，M6表示两年生霍山石斛叶，M7表示一年生霍山石斛茎，M8表示两年生霍山石斛茎，M9表示三年生霍山石斛茎。

由图1可知：从左到右分别为没食子酸对照品、一年生霍山石斛根、两年生霍山石斛根和三年生霍山石斛根；可以看出，两年生霍山石斛根斑点最深，三年生霍山石斛斑点最浅多酚含量：两年>一年>三年。

由图2可知：从左到右分别为没食子酸对照品、一年生霍山石斛叶和两年生霍山石斛叶；可以看出，两年生斑点颜色比一年生斑点颜色深，多酚含量：两年>一年。因此，霍山石斛多酚含量从一年到两年为递增；由于三年以上生霍山石斛叶片基本脱落，故无数据。

由图3可知：从左到右分别为没食子酸对照品、一年生霍山石斛茎、两年生霍山石斛茎和三年生霍山石斛茎；可以看出，三年生斑点最深，一年生最浅，多酚含量：三年>两年>一年，说明霍山石斛茎多酚含量随着年限依次递增。

三组色谱图中，没食子酸对照品对应的斑点处与其他部位的斑点处在同一高度上，可知多酚中含有没食子酸，可以依据没食子酸的标准曲线来测得石斛中多酚的含量。

2.2 没食子酸标准曲线的绘制

根据没食子酸标准品测得吸光度，质量浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL的吸光度如表1所示。

表1 没食子酸各浓度下吸光度

配置得到没食子酸标准品溶液后测定其吸光度，由不同浓度与吸光度的对应关系得到回归方程Y= 53.077X+ 0.0366，R2= 0.9997(见图4)。式中：Y为吸光度，X为没食子酸标准品浓度。

图4 没食子酸标准曲线

2.3 不同年限、不同部位霍山石斛多酚含量

在相同的条件下测得不同年限、不同部位霍山石斛的多酚吸光度如表2所示。

表2 不同年限、不同部位霍山石斛吸光度

将表1中的吸光度代入没食子酸标准曲线方程，结果如图5所示。

图5 不同年限、不同部位霍山石斛多酚含量

由图5可以看出，一年生霍山石斛根、茎、叶的多酚含量分别为0.307%、0.341%和0.379%；两年生霍山石斛根、茎、叶的多酚含量分别为0.362%、0.391%和0.547%；三年生霍山石斛根、茎的多酚含量分别为0.295%和0.447%。

3 结论与讨论

本文主要研究不同年限、不同部位霍山石斛多酚含量差异，为不同年限、不同部位霍山石斛的药用价值研究提供重要实验数据。薄层色谱出现拖尾现象可能是硅胶板吸附剂上点样量超载所导致。多酚的提取率低于理论提取率，造成的原因可能是：称量用料时造成误差或者器材未清洗完全，实验提取温度没有达到提取率最高的最佳温度，多酚提取液纯度不高对实验结果造成了影响。

根据没食子酸标准曲线和测得的吸光度得出，一年生霍山石斛根、茎、叶的多酚含量分别为0.307%、0.341%和0.379%；两年生霍山石斛根、茎、叶的多酚含量分别为0.362%、0.391%和0.547%；三年生霍山石斛根、茎的多酚含量分别为0.295%和0.447%。由此可知，霍山石斛茎的多酚成分年限越久，其含量越高。霍山石斛根的多酚含量两年生最高，一年生其次，三年生最少，推测原因是三年生石斛根开始腐败引起多酚含量的降低；由于三年以上生石斛叶在本实验期间脱落，故未做此实验，但两年生叶片多酚含量多于一年生叶片。随着生长年限增加，霍山石斛叶、茎多酚含量呈增加趋势，但是根的品质可能会随着年份的增加而逐渐变差。研究不同年限、不同部位多酚含量对于霍山石斛的开发利用具有良好意义，可以为霍山石斛的药用价值研究提供重要的基础数据。