宫颈癌组织差异表达环状RNA筛选及通路分析*

张纱纱，蒋刚，王茜，龙方懿，王婷

610041 成都，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院 药学部(张纱纱、蒋刚、王茜、王婷)；610031成都，四川省妇幼保健院 实验医学中心(龙方懿)

宫颈癌是女性最常发生的肿瘤之一，是女性癌症相关性死亡的第4大原因，2018年全球新发病例57万，有31万妇女死于该肿瘤[1]。人类乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)被认为是导致宫颈癌的主要因素，虽然目前已有HPV疫苗用于宫颈癌的预防，但其仍然威胁着女性的生命健康且呈现出年轻化趋势[2]。目前针对宫颈癌的主要治疗包括基于铂类的化疗和局部放疗及联合治疗。虽然近年来其他治疗手段如分子靶向、免疫治疗也发挥着重要作用[3]，但是宫颈癌的临床治疗仍然存在较大的挑战，所以迫切需要开辟新的治疗靶点。

环状RNA(circular RNA，circRNA)早在40年前被首次报道，但由于其表达量低，常被认为是信使RNA(messenger RNA，mRNA)错误剪切的产物，随着高通量测序技术的进步，人们发现circRNA在人类肿瘤组织中表达丰富，在脑部等组织中的表达甚至高于相应的mRNA[4-5]。不同于以往的线性RNA，circRNA是一类具有共价闭环结构的非编码RNA，具有高度的稳定性和保守性，且在不同的疾病和疾病的不同阶段表现出特异性。目前大量研究发现其可以调控肿瘤的增殖、迁移、侵袭和提高治疗的敏感性[5-7]。既往有报道将GEO数据库中发表过的宫颈癌组织和宫颈癌细胞系基因芯片联合分析[8-9]寻找差异表达的circRNA，然而由于体外建立的细胞系因生存环境的不同可能会发生基因的丢失、漂移等，和其在体内肿瘤组织内的表达存在一定的差异，两者联合分析会导致最后获得的差异表达circRNA存在偏差。本研究基于GEO数据库中两个宫颈癌组织芯片筛选差异表达显著的circRNA，为宫颈癌诊断和治疗寻找更多有意义的信号通路，从而希望为宫颈癌的诊断和治疗提供更多策略。

1 资料与方法

1.1 资料来源

以“cervical cancer”“circRNA”为关键词在GEO数据库中检索，排除非人类组织及宫颈癌细胞系芯片，共获得两个人类宫颈癌组织芯片数据GSE90737[10]和GSE102686[11]，GSE90737包含10个宫颈癌组织及10个癌旁组织，通过GPL22722 Agilent-075784 CapitalBio Human CircRNA Array V1.0芯片平台分析；GSE102686包含5个宫颈癌组织和5个癌旁组织，通过GPL19978 Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA Microarray V1芯片平台分析。

1.2 差异表达circRNA的筛选

通过Strawberry perl 5.32软件将探针矩阵转换成circbase数据库标准的circRNA名称，并将两个芯片数据合并以便进一步分析。通过R 4.1软件的sva包和limma包对芯片数据进行校正和归一化，使用limma包(采用Benjamini-Hochberg方法对P值进行校正)进行差异表达circRNA的筛选，设定筛选条件为癌组织相对正常组织表达量变化|logFC|≥1倍(相当于差异表达2倍)且校正后P<0.05，得到差异表达的circRNA，并利用R 4.1软件的limma包和pheatmap包构建差异表达circRNA的火山图和热图。

1.3 差异表达circRNA结合的miRNA

分别选取5个上调和下调差异表达最显著(以|logFC|排序)的circRNA，利用circinteractome预测网站预测差异表达最显著的circRNA结合的miRNA，将评分大于80的miRNA定义为潜在靶点。利用Cytoscape 3.9软件构建差异表达的circRNA/miRNAs相互作用网络。

1.4 mRNA预测及功能分析

通过3个生物信息学网站：miRDB、TargetScan及miRTarBase，预测每个miRNA的下游mRNA，结果以3个数据库均能预测即评分为3分的mRNA定义为靶mRNA。利用Metascape数据库对靶mRNA进行基因本体论(Gene Ontology，GO)、京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，筛选条件为P<0.01。

1.5 靶mRNA蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络分析及关键mRNA筛选

将靶mRNA导入STRING在线工具获得PPI网络，并得到靶mRNA节点关系，再利用R 4.1软件进行整合，将获得节点数最多的mRNA作为宫颈癌的关键mRNA。

1.6 关键mRNA表达与患者预后的关系分析

利用Kaplan-Meier Plotter 在线数据库，在 pan-cancer 里选中包含 304 例宫颈癌患者的数据库，输入关键mRNA，分析关键mRNA表达水平与宫颈癌患者预后的关系。

1.7 获得宫颈癌预后相关circRNA-miRNA-mRNA调控路径

追踪预后相关mRNA的上游miRNA和circRNA，获得相应的circRNA-miRNA-mRNA 调控路径。

2 结 果

2.1 差异表达的circRNA

通过对宫颈癌组织和正常癌旁组织的差异分析，共筛选出75个差异表达的circRNA，其中在宫颈癌组织中表达上调的有54个，表达下调的有21个。火山图和热图能更直接地显示circRNA 的差异(图1)。分别选取上调和下调组中差异表达最显著的5个circRNA(表1)进行后续分析。

图1 差异表达的circRNA的筛选

表1 宫颈癌组织中差异表达上调/下调前5的circRNA

2.2 预测差异表达circRNA结合的miRNA

通过circinteractome预测网站获得上述10个显著差异表达circRNA结合的miRNA共202个，其中表达上调circRNA结合的miRNA为75个、表达下调circRNA结合的miRNA为127个，利用cytoscope 3.9软件构建的circRNA/miRNAs的相互作用网络见图2，从图中可以看出上调circRNA里hsa_circ_0079557、hsa_circ_0000467结合的miRNA最多，都为19个，下调circRNA里hsa_circ_0001446结合的miRNA最多，为34个，其次为hsa_circ_0008144,结合31个。

图2 差异表达最显著的10个circRNA及其结合的miRNA的网络图

2.3 mRNA预测及功能分析

通过3个生物信息学网站(miRDB、TargetScan、miRTarBase)均能预测到且得分为3分的miRNA靶mRNA共935个。Metascape在线数据库分析上述935个mRNA的GO和KEGG功能，显示这些mRNA富集于mRNA代谢调节、转录分子结合、转录酶复合物及肌肉的形成、细胞器组织调节，以及特异性蛋白质结合、肿瘤形成调控等生物学过程(图3)。

图3 靶mRNA的GO和KEGG功能富集图

2.4 PPI网络分析及宫颈癌关键mRNA

将上述935个靶mRNA导入STRING在线工具，得到PPI网络(图4)，再通过R 4.1软件筛选出6个关键mRNA(POLR2D、JUN、CTNNB1、H2AFZ、RBBP7、UBE2D1)。

图4 预测mRNA的PPI网络

2.5 关键mRNA表达与患者预后的关系

将关键mRNA导入Kaplan-Meier Plotter 在线数据库后发现POLR2D、JUN、CTNNB1、H2AFZ、RBBP7五个mRNA表达均与宫颈癌患者总生存率有关(P<0.05)(图5)。

图5 6个关键mRNA与宫颈癌患者预后的关系

2.6 获得宫颈癌预后相关circRNA-miRNA-mRNA调控路径

上述结果表明POLR2D、JUN、CTNNB1、H2AFZ、RBBP7与宫颈癌患者总生存率有关，基于宫颈癌预后相关mRNA追溯上游miRNA和circRNA，从而构建circRNA-miRNA-mRNA调控路径。POLR2D对应的上游miRNA和circRNA分别是hsa-miR-421，hsa_circ_0068894，JUN对应的上游miRNA和circRNA分别是hsa-miR-139-5p，hsa_circ_0027821，构建获得hsa_circ_0068894/hsa-miR-421/POLR2D，hsa_circ_0027821/hsa-miR-139-5p/JUN等circRNA-miRNA-mRNA调控路径。其余基于宫颈癌预后相关基因的circRNA-miRNA-mRNA调控路径见表2。

表2 关键mRNA对应的上游miRNA和circRNA

3 讨 论

近年来，基于RNA等转录组学探索肿瘤诊断和预防新靶点已成为研究热点。既往发现基因的突变驱动着癌症的发生，而调控基因的上游通路是十分复杂的，miRNA和circRNA是近几年发现的上游靶点[12]。miRNA是一类具有短核苷酸的非编码RNA，可以参与多种细胞生物学途径，包括细胞增殖、侵袭、分化和凋亡，并扮演致癌基因或抑癌基因的作用，所以miRNA被认为是癌症的重要生物标志物和治疗靶标[13]。circRNA是一类具有闭环结构的非编码RNA，具有高度稳定性和保守性，可与RNA结合蛋白相互作用并充当蛋白支架，还可以调控基因的剪切、转录和翻译，充当自噬调节剂等[7]，除此之外，circRNA最重要的作用是可以充当miRNA的海绵并调节miRNA参与的各种细胞途径，circRNA可以吸附大量miRNA从而影响相关miRNA及mRNA的表达，并通过circRNA-miRNA-mRNA 通路影响多种恶性肿瘤的生长、转移等生物学过程[7,14]。目前已经发现大量的miRNA及circRNA对宫颈癌的发生发展具有重要的调控作用。如miR-491-5p可通过调节人类端粒酶逆转录酶、丙酮酸激酶调控宫颈癌细胞的生长和转移[15]。Juan等[16]研究表明 miR-489可调控PI3K/AKT/p53信号通路，抑制宫颈癌细胞的增殖并刺激细胞凋亡，被认为是宫颈癌治疗的生物标志物。Nahand等[17]综述了目前发表的各种miRNA如miR-21、miR-218、miR-143、miR-886-5p等在宫颈癌发生发展、治疗中的作用，证明miRNA已成为诊断、治疗和检测宫颈癌治疗反应的关键生物标志物。CircRNA在宫颈癌中的研究相比miRNA较少，既往已经报道过hsa_circ_101996在宫颈癌组织中的表达水平与TNM分期、肿瘤大小和淋巴结转移呈正相关，且hsa_circ_101996高表达与宫颈癌患者预后较差相关。体外细胞实验表明hsa_circ_101996高表达的细胞miR-8075表达下调，而miR-8075的下游mRNA TPX2上调，从而介导了宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[18]。此外，hsa_circ_0075341表达上调可调节miR-149-5p/AURKA轴促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭[19]。靶向hsa_circ_0000263/miR-150-5p/MDM4/p53调控网络也可抑制宫颈癌细胞增殖和迁移[20]。这些研究表明异常表达的circRNA可通过circRNA-miRNA-mRNA通路调控宫颈癌的发生发展，但目前对宫颈癌circRNA及其通路的认识仍不够充分。

本研究通过GEO数据库挖掘的两个circRNA芯片数据，获得在宫颈癌组织中75个差异表达的circRNA，包括54个上调circRNA和21个下调circRNA，分别选取上、下调最显著的5个circRNA并进一步通过预测网站获得202个下游miRNA和953个靶mRNA，再筛选出了蛋白互作网络中节点数目最多的6个关键mRNA，并通过Kaplan-Meier Plotter在线数据库预测了关键mRNA和患者总生存率之间的关系，然后利用5个预后相关mRNA追踪上游miRNA和circRNA，从而确定了8条circRNA-miRNA-mRNA调控路径。同时，在下调的circRNA中，hsa_circ_0001446吸附的miRNA最多，可以推测hsa_circ_0001446具有较强的吸附力，预示着其可能是一个重要的调控因子。此外，根据8条circRNA-miRNA-mRNA路径发现,hsa_circ_0027821可以调节JUN,CTNNB1,H2AFZ三个宫颈癌预后相关mRNA的表达，表明其可能与宫颈癌预后相关。有研究发现hsa_circ_0027821的下游miRNA hsa-miR-139-5p可以通过靶向T细胞因子来抑制Wnt/β-catenin信号传导，是宫颈癌发病机制中至关重要的肿瘤抑制因子[21]。而在宫颈癌组织中表达上调最显著的hsa_circ_0084927还可以通过充当hsa-miR-634的海绵调节mRNA TPD52的表达，所以靶向hsa_circ_0084927/hsa-miR-634/TPD52调控通路也可能是诊断和治疗宫颈癌的潜在通路[22]。而circRNA下游预后相关mRNA CTNNB1被报道可以被其他癌症相关基因结合和激活来上调Wnt/β-catenin信号通路的活性，从而促进宫颈癌细胞的增殖和肿瘤形成[23]。这些发现表明circRNA及其下游miRNA和mRNA可以通过影响Wnt/β-catenin通路及细胞因子等影响宫颈癌的发生及预后。此外，circRNA调控下游mRNA功能富集分析表明，circRNA可以通过调节mRNA代谢及结合转录分子和特异性蛋白质等过程影响宫颈癌的发生和预后。所以circRNA影响宫颈癌的发生和预后是多因素、多途径的，认识更多的circRNA及其调控通路对宫颈癌的诊断和治疗及其重要。

综上，通过GEO数据库两个宫颈癌组织芯片分析获得hsa_circ_0068894、hsa_circ_0027821、hsa_circ_0079557、hsa_circ_0008144等在宫颈癌组织中差异表达显著，并预测得到了8条circRNA-miRNA-mRNA调控通路。该研究通过生物信息学方法挖掘到了更多的circRNA及其调控通路，加深了目前对宫颈癌circRNA及其调控通路的认识，有助于找到治疗宫颈癌的新方法。尽管一部分circRNA的调控通路已经阐明，但是大部分circRNA的分子机制还有待进一步实验验证，期待研究结果有助于发现宫颈癌临床诊断和治疗的新靶点，为宫颈癌患者提供更多诊断和治疗策略。

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