苏姜猪组织中SIRT6蛋白的表达分布

陈章言， 张 伟*

(1. 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300； 2.江苏姜曲海种猪场， 江苏 泰州 225300)

0 引言

【研究意义】沉默信息调节蛋白2(Silent information regulator 2, Sir2)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Adenine dinucleotide, NAD)的去乙酰化酶，广泛存在于从细菌到人类的各种生物体中[1]。SIRT6是Sir2中重要的同源基因之一，SIRT6的缺失导致动物表型出现显著的改变。因此，系统地开展猪组织中SIRT6蛋白表达和定位检测分析，对于丰富猪SIRT6基因的功能特征，进而辅助优质猪种的分子生物选育具有重要的意义。【前人研究进展】在真核生物中，Sir2调节转录抑制、重组、细胞分裂周期、微管组织和细胞对DNA损伤因子的反应，Sir2也参与调节衰老的分子机制[2]。Sir2催化域由2个不同的域组成，分别与NAD和乙酰赖氨酸底物结合。除催化域外，真核生物的Sir2还包含可变的氨基和羧基末端延伸，调节其亚细胞定位和催化活性[3]。哺乳动物有7个Sir2，分别包括SIRT1～SIRT7同源基因，影响衰老和新陈代谢。这些蛋白能够结合转录因子、信号转导因子、细胞骨架蛋白等多种因子，通过去乙酰化反应或ADP(Adenosine diphosphate)核糖转移反应参与能量代谢、基因沉默、DNA损伤修复、细胞周期调控和细胞分化等功能过程，是生物学功能十分广泛并且作用较为重要的酶类[4]。SIRT6是一种与染色质结合的核蛋白。当SIRT6缺陷小鼠出生时表现正常，但约3周后，出现急性退化过程，并在30 d内死亡。这些缺陷包括严重的代谢失衡，血清IGF-1水平降低，皮下脂肪完全丧失，淋巴减少，骨质减少，急性低血糖发作，最终导致死亡[5]。此外，SIRT6可以促进对DNA损伤和氧化应激的抵抗，并抑制小鼠细胞的基因组不稳定性，与SIRT6参与基底切除和DNA修复作用有关。最近的研究表明，SIRT6位于人类细胞的端粒，这些细胞中SIRT6的下调改变端粒结构，导致衰老加速和端粒依赖的基因组不稳定[6]。【研究切入点】截至目前，有关猪SIRT6蛋白在组织中表达分布的研究较少，且尚未见在苏姜猪组织中表达的研究报道。【拟解决的关键问题】因此，分析苏姜猪SIRT6组织表达和定位检测，通过免疫组织化学与ELISA方法，检测分析苏姜猪不同脏器组织中SIRT6蛋白的特定表达部位与表达量差异，旨在深入了解SIRT6基因在猪组织中的表达特征及功能，进而为优质猪种的选育提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 苏姜猪 选取体重约100 kg苏姜猪6头(公、母各3头)。

1.1.2 试剂 DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物公司，SIRT6 ELISA试剂盒购自南京奥青生物技术有限公司。

1.2 苏姜猪样品采集及处理

屠宰后立即采集猪的心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、腹部脂肪、背最长肌、腿肌和胃部组织，采出的各组织样品在生理盐水中清洗后，用刀片将组织分别切成均匀小块，置于冻存管快速转移到-80℃保存。用于酶联免疫分析(ELISA)，同时采集各组织样本置于10%中性福尔马林溶液中固定，为后续免疫组织化学检测提供材料。

1.3 不同组织器官中SIRT6细胞学定位检测

参照HUANG[7]的方法进行苏姜猪组织样中SIRT6免疫组织化学检测分析。首先将石蜡切片脱蜡水化后，PBS清洗2次后，3%H2O2室温反应5～10 min，蒸馏水洗3次；用pH 6.0的柠檬酸抗原修复液对组织进行修复，100℃修复持续3 min，PBS洗3次；滴加正常山羊血清封闭液，室温30 min，甩去多余液体，滴加SIRT6一抗(CST，1∶250)，4℃过夜，PBS洗3次；滴加生物素化山羊抗兔gG，37℃反应30 min，PBC洗3次；滴加试剂SABC，37℃反应30 min，PBS洗3次；DAB显色，苏木素复染；脱水、透明、封片、显微镜下镜检，观察SIRT6在苏姜猪不同组织中的分布定位和表达情况。

1.4 不同组织器官中SIRT6蛋白含量测定

将采集的各组织样从-80℃冰箱取出，加入PBS(pH 7.4)，用匀浆器充分匀浆，离心20 min(2 000～3 000 r/min)。仔细收集上清，用SIRT6 ELISA试剂盒检测组织中SIRT6蛋白含量。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.5 统计分析

2 结果与分析

2.1 SIRT6在苏姜猪各组织中的细胞学定位

通过免疫组织化学技术，在公、母苏姜猪的心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、腹部脂肪、背最长肌、腿肌等组织中均检测到SIRT6免疫阳性细胞。从图1可见，SIRT6免疫阳性颗粒主要定位于心脏的心肌细胞、背最长肌和腿肌的肌细胞、胃组织的肌细胞和腺细胞、小肠和大肠的肠腺细胞、脾脏的红髓区细胞、肝脏的肝细胞、肺脏的肺泡和支气管上皮细胞、肾脏的近曲小管和远曲小管内皮细胞、腹部脂肪的脂细胞等，各器官组织构成细胞的细胞质中。

图1 SIRT6在苏姜猪多种组织内的分布

2.2 苏姜猪各组织中SIRT6蛋白的表达量

由图2可见，检测的公、母苏姜猪11种组织中，均检测到SIRT6蛋白的表达，且公猪组织中的表达量均高于母猪，SIRT6蛋白在公猪心脏、腹部脂肪及腿肌组织中的表达水平显著高于母猪。公猪SIRT6蛋白在胃组织中表达量相对最高，显著高于心、肝、脾、肺和腹脂组织中表达量。对比母猪不同组织中SIRT6蛋白表达量小肠组相对最高，显著高于肝、脾、腹脂、背最长肌和腿肌组织中表达量，其次是肺组织中SIRT6蛋白表达量相对较高，显著高于腹脂和腿肌组织中的表达量。

注：不同大小写字母分别表示公猪和母猪各组织间表达量差异显著(P<0.05)；*表示同种组织公母猪之间表达量差异显著(P<0.05)。

3 讨论

苏姜猪是以姜曲海猪、杜洛克猪为基础种质培育而成的新型国家级瘦肉品种猪，具有产仔数高、耐粗饲、适应性强、肉质优良等特点，国家农业部2016年将其列为主推猪品种。随着生活水平的提高，消费者对猪肉的品质及色相有了更高的要求。

SIRT家族基因在哺乳动物细胞中广泛分布，该基因家族的生物学功能及其与畜禽肉质、生长等性状息息相关。SIRT家族基因是近年来出现的多种生物过程的关键调节剂，调节细胞代谢、DNA修复、基因表达和线粒体生物学。因此，在机体内环境平衡中发挥着关键作用，而这些蛋白的缺陷与多种疾病有关，包括癌症、神经退行性变和衰老[8]。SIRT6是Sirtuin家族NAD依赖性酶的成员之一，在染色质信号和基因组维护中发挥重要作用。该研究通过ELISA和免疫组织化学方法在苏姜猪11个组织中均检测到SIRT6蛋白表达，表明苏姜猪组织中SIRT6表达具有广泛性，与在小鼠[9]、牛[10]等观察结果一致。

SIRT6酶可以预防与衰老相关的疾病，包括代谢疾病和癌症，并可以延长小鼠寿命。过去几年的研究表明，SIRT6是一种具有多种底物和催化活性的复合酶，并发现了SIRT6在维持机体健康方面的新功能。大量研究表明，SIRT6能够维持基因组稳定(在DNA同源重组中发挥着重要作用)，并能延长机体寿命，因为热量限制影响SIRT6基因的蛋白表达量[11]。对饥饿小鼠体内的SIRT6基因进行研究发现，其蛋白稳定性和表达量均增高，促进了基因组稳定性，进而延长小鼠寿命；同时，SIRT6基因的过表达能降低关节炎等炎症的发生率[11]，同时其是肿瘤抑制基因，能通过增强基因组的稳定性而降低机体肿瘤和衰老的发生率。该研究显示，苏姜公猪胃组织中SIRT6蛋白的表达含量相对最高，而在苏姜母猪的小肠组织中的表达量相对最高，说明苏姜公猪胃部的稳定性最高，抵抗力也最强；而苏姜母猪的小肠稳定性最高，可能更有利于营养物质的吸收。

在动物机体物质和能量代谢过程中SIRT6也发挥着重要的作用。通过比较公母2组苏姜猪各组织中SIRT6蛋白水平，发现公猪在各组织器官的表达水平均高于母猪，表明该蛋白在性别方面存在差异，这可能与母猪的生长势较公猪弱(如苏姜猪成年公猪平均体重204 kg，母猪体重168 kg)的特点相符[3]。

通过免疫组织化学方法，在测定的11种苏姜猪组织中均检测到SIRT6免疫阳性颗粒。肝脏是动物机体内重要的代谢器官，是糖代谢的调控具有重要意义。研究发现，SIRT6是葡萄糖稳态的核心调节者，其功能对糖异生与糖酵解均有影响。研究发现，SIRT6能够强烈调节PGC-1α乙酰化作用，通过诱导PGC-1α乙酰化，从而抑制肝葡萄糖生成[12]。该研究在公猪的肝脏中检测到丰富的SIRT6免疫阳性颗粒。可能与SIRT6抑制糖异生，使更多的葡萄糖转化为脂肪，进而增加雄性猪的体重有关。机体最大的免疫器官——脾脏含有大量淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。通过细胞定位发现，SIRT6免疫阳性颗粒主要分布于苏姜猪脾脏的红髓细胞。肌肉是动物机体能量代谢的主要组织。该研究在苏姜猪心脏、背最长肌和腿肌的肌细胞中均检测到SIRT6免疫阳性颗粒，表明SIRT6在苏姜猪能量代谢过程中也具有重要作用。在消化系统的胃、小肠和大肠组织中，SIRT6免疫阳颗粒主要出现在腺细胞中，表明在腺体分泌过程中具有重要的作用。

4 结论

SIRT6在苏姜猪组织中具有表达广泛性，其中，在物质能量代谢较旺盛组织和腺体分泌组织中相对表达量较高，此外，苏姜公猪组织中SIRT6蛋白表达量相对高于母猪，研究结果为深入开展优质肉用猪种的选育提供理论依据。