2013—2020年四川大学华西医院寄生虫形态学室间质量评价结果分析

邓山鹰，裴雨晴，张春莹，谢 恒，蒙 强，马 莹

（四川大学华西医院实验医学科，四川 成都 610041）

室间质量评价（external quality assessment，EQA）又被称为能力验证，是促进检测结果准确性与可靠性的有效措施，目的在于评价实验室的能力，确认实验室间的差异。美国病理家学会（the College of American Pathologists，CAP）的寄生虫检测能力比对采用粪便湿片样本，要求参加者自行涂片后镜检，样本和操作与临床一致，不仅考核检验人员辨认寄生虫的能力，也考核其发现寄生虫的能力。我国国家卫生健康委临床检验中心（简称临检中心）寄生虫形态学室间质量评价活动采用通过图片识别寄生虫形态的形式，客观、有效地考评检验人员寄生虫识别能力。本研究对2013—2020年四川大学华西医院参加CAP和临检中心寄生虫形态学EQA的结果进行回顾分析，并结合工作实际，归纳了相似寄生虫（卵）的形态特征。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集2013—2020年四川大学华西医院寄生虫形态学EQA的200份样本的回报结果，其中CAP 80份，临检中心120份。

1.2 方法

1.2.1 CAP样本检测 CAP寄生虫形态学EQA每年3次，每次5个样本。由于海关原因，2014、2017年只有2次，2016、2020年0次。每次收到样本后，均严格按第4版《全国临床检验操作规程》中寄生虫湿片检查的要求进行操作[1]，将样本混匀后，滴1滴在洁净载玻片上，盖上盖玻片，涂片厚度以透过玻片可隐约辨认书上字迹为宜。先在低倍镜下按从左到右、从上到下的顺序查找全片；找到疑似寄生虫（卵）后，在高倍镜下观察细微结构；计数全片查见的寄生虫（卵）数量，1～2个虫卵为少量，3～9个为中等量，≥10个为大量。检测结果包括查见的寄生虫（卵）种类和数量。将结果在线报告给CAP后，CAP以线上形式回报，并对所有参评实验室的结果做出评价。

1.2.2 临检中心样本检测 临检中心寄生虫形态学EQA每年1次，每次15张图片，每张图片上附有寄生虫大小、染色方法、放大倍数等信息。由科室所有寄生虫检测人员轮流、独立进行形态识别，可参阅相关形态学图谱[2-3]，将其中1位检测人员的检测结果作为实验室结果在线上报，临检中心以线上形式回报结果，并对结果做出评价。

2 结果

2.1 识别正确率

80份CAP样本中，有77份识别正确，3份识别错误，12份未评分，正确率为96.3%；120份临检中心样本中，118份识别正确，2份识别错误，正确率为98.3%。全部200份样本的正确率为97.5%。5次识别错误的寄生虫见表1。

表1 2013—2020年EQA寄生虫识别错误结果

200份CAP与临检中心样本涉及30种寄生虫的47种不同生活史形态，包括医学原虫、医学蠕虫和医学节肢动物。具体虫种和不同生活史形态见表2。

表2 2013—2020年EQA涉及寄生虫虫种和生活史形态

CAP样本存在寄生虫量分布不均，且同一样本含多种寄生虫（卵）的情况，只有评审员与所有参评实验室在该样本的上报一致性比例均＞80%时才会评分。8年中，本实验室上报的样本中共有12份未评分，其中11份均是评审员和参评实验室缺乏共识；而对于样本2013 P3-17，虽然选择查见寄生虫的参评实验室中有97.4%鉴定为蓝氏贾第鞭毛虫包囊，但由于有25.0%的参评实验室未查见寄生虫，所以该样本被判定为有问题样本而未评分；具体情况见表3。未评分样本中易漏检、难辨认原虫的鉴别特征见表4。

表3 2013—2020年CAP寄生虫EQA未评分样本

表4 未评分样本中易漏检且较难辨认原虫鉴别特征

3 讨论

2013—2020年，CAP和临检中心寄生虫EQA样本中出现了30种寄生的47种生活史形态。CAP样本由于是粪便样本，所考核的寄生虫（卵）均是肠道寄生虫，以蓝氏贾第鞭毛虫包囊出现次数最多，其次是鞭虫卵、钩虫卵、粪类圆线虫幼虫和带绦虫卵。临检中心的考核是以图片的形式，除涉及肠道寄生虫外，还包括血液、骨髓、组织、体液样本中出现的寄生虫，以疟原虫的各种形态出现次数最多，其次是华支睾吸虫（卵）、日本血吸虫（卵）、蛔虫卵、肺吸虫（卵）、微丝蚴。由于地域的差异和考评形式的不同，CAP与临检中心的EQA侧重点稍有不同，故而考核的内容可以在一定程度上互补。本实验室近几年在实际工作中发现的寄生虫以钩虫卵为主，其次是人芽囊原虫、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、华支睾吸虫卵与绦虫卵，所有寄生虫类型均在EQA考核范围内。

从本实验室5次样本识别错误的原因来看，临检中心的2次样本识别错误均是由于图片中寄生虫的特殊形态结构不清晰所造成：结肠内阿米巴滋养体与溶组织阿米巴滋养体的主要鉴别要点在于核仁，前者核仁大，略偏位，核周染色质大小不一；后者核仁小，居中，核周染色质大小一致，常生出指状或舌状单一的伪足（图1），因该图片核仁不明显，影响了检测人员的判断。马来微丝蚴与班氏微丝蚴的主要鉴别要点在于体核与尾核，前者体核不均，有2个尾核前后排列；后者体核均匀，无尾核（图2）。从临检中心考核微丝蚴的图片上可以看出，每幅图中只有1条微丝蚴，且个别图片中的结构特点比较模糊，无法从体核跟尾核上准确判断是哪种微丝蚴，增加了辨认的难度。在实际工作中，微丝蚴往往不止1条，便于特殊结构的观察，建议临检中心可以在同一图片上展示多条微丝蚴，以便参评实验室更好地识别。

图1 结肠内阿米巴滋养体与溶组织阿米巴滋养体（三原染色，×1 000）（图片来源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

图2 马来微丝蚴与班氏微丝蚴（吉姆萨氏染色，×1 000）（图片来源于临检中心）

CAP识别错误中，有1次是在识别出姜片/肝片虫卵的同时，把不典型的虫卵误认为是裂头绦虫卵，同时上报了2种虫卵，被判定为错误。阔节裂头绦虫卵、肺吸虫卵、姜片虫卵、肝片吸虫卵形态相似，应注意鉴别。通过对几种虫卵进行复习、比较和观察，总结了它们各自的形态特点，除姜片虫卵和肝片虫卵在光镜下较难区别外，其他几种虫卵均可以通过各自的特点，如虫卵的大小、卵壳的厚薄、卵盖的大小和形态进行鉴别：阔节裂头绦虫卵为浅灰褐色，大小为（58～76）μm×（40～51）μm，有卵盖和小棘；肺吸虫卵为金黄色，较阔节裂头绦虫卵大[（68～118）μm×（39～67）μm]，卵壳厚薄不均，卵盖扁平且宽；姜片虫卵为淡黄色，卵壳薄、卵盖小且不明显，是常见蠕虫卵中最大的虫卵[（130～150）μm×（60～90）μm]（图3）。另外2次CAP错误都是由于样本中寄生虫（卵）数量少而漏检，其中1次是漏了样本中的粪类圆线虫幼虫，上报了鞭虫卵。从回报结果可以看出，有33.3%的评审员与18.3%的参评实验室均看到了鞭虫卵，有42.9%的参评实验室未查见寄生虫，说明该样本中寄生虫的量存在分布不均的情况。

图3 有卵盖且形态相似的寄生虫卵（0.9% NaCl溶液涂片，×400）（图片来源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

从CAP的回报结果中不仅可以看到所有参评实验室在各个样本中检出的寄生虫（卵）分布情况，而且资料中还会说明该样本考核的目标寄生虫（卵），以及是否存在2种及以上的寄生虫（卵），最后还会将考核寄生虫的形态、生活史等相关资料，以及上报结果中出现的相似寄生虫（卵）的鉴别要点及难点进行详细说明。所以我们可以从12份未评分样本回报资料中各参评实验室的上报情况看出，对大多数实验室而言，难点都是相似的，即原虫的识别以及一些少见虫卵的鉴别。通过对未评分样本中考核的易漏检且较难辨认的原虫进行复习、比较和湿片查找，本实验室总结了它们各自的形态特征（表4、图4）。其中人芽囊原虫近年来在本实验室的检出率越来越高，该寄生虫是一种呈世界性分布，且动物宿主广泛的人兽共患寄生原虫，属于机会致病病原体，其感染率在不同国家和地区间差异显著[4]，除南极洲以外的各大洲均有人芽囊原虫流行的相关报道[5]。尽管对于人芽囊原虫的致病性尚存在一定争议，但随着近年来人类对人芽囊原虫认识的深入，越来越多的证据表明，人芽囊原虫与人类多种疾病密切相关，其中胃肠道疾病最常见[6]，临床症状以腹痛、腹泻最多[11]，并且人芽囊原虫感染还可能是荨麻疹和皮肤病的一个重要病因[7-8]。这些研究结果表明，人芽囊原虫具有潜在致病性。因此，正确识别人芽囊原虫对相关疾病的治疗非常重要。

图4 未评分样本中易漏检且较难辨认原虫（碘染色，×400）（图片来源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

从样本2015 P3-13的参评实验室上报结果可以看出，上报结果为考核目标的缩小膜壳绦虫卵的比例比上报结果为微小膜壳绦虫卵的低。这2种虫卵在临床工作中均比较少见，在鉴别上存在一定困难，特别是当标本不新鲜时，会增加识别难度。2种虫卵的鉴别要点在于：缩小膜壳绦虫卵卵壳较厚，胚膜两端无极丝，卵壳与胚膜间有辐射状条纹；微小膜壳绦虫卵卵壳较薄，卵壳与胚膜间无辐射状条纹，胚膜两端凸起，有2～4对极丝（图5）。

图5 缩小膜壳绦虫卵与微小膜壳绦虫卵（0.9% NaCl溶液涂片，×400）

EQA（特别是临检中心EQA）中考核的蛔虫卵与钩虫卵形态多样，我们在日常检测中也会遇到。如脱蛋白质膜的受精蛔虫卵和退变钩虫卵，由于与典型虫卵在形态上存在一定差异而容易误认。脱蛋白质膜受精蛔虫卵的特点是：卵壳厚，呈双线层，卵壳和卵细胞之间可见新月形空隙。退变钩虫卵的特点是：卵壳薄、卵细胞融合为1团，体积变小，卵壳和卵细胞之间空隙更加明显。另外，如果患者便秘，或粪便放置过久，钩虫卵内细胞分裂为多细胞期，则与东方毛圆线虫卵形态相似，东方毛圆线虫卵比钩虫卵稍大，为长圆形，长一般为宽的2倍以上，一端较尖，卵内细胞为10～20个（图6）。蛔虫卵和钩虫卵是临床上常见的虫卵，因此它们的各种形态的辨认都非常重要。

图6 钩虫卵与蛔虫卵、东方毛圆线虫卵（0.9% NaCl涂片，×400）[（b）图片来源于临检中心；（c）、（d）图片来源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html]

对于粪便样本，除需要辨认各种相似虫卵外，还存在各种食物残渣，形态各异，有的看上去与某些寄生虫（卵）相似，容易误认。如华支睾吸虫卵和灵芝孢子在形态上非常相似，两者的鉴别要点是：华支睾吸虫卵比灵芝孢子大，呈淡黄褐色，在低倍镜下形似芝麻，高倍镜下可见明显的卵盖、肩峰、小疣、内含毛蚴；而灵芝孢子呈棕色，且不具备这些结构（图7）。含有灵芝孢子的粪便样本通常呈棕褐色，并且就诊者均曾服用过灵芝孢子类药物或保健品。因华支睾吸虫感染与胆结石、胆囊炎等肝胆系统并发症密切相关，且是明确的胆管癌致癌物[9-12]，故正确识别华支睾吸虫卵对临床治疗意义重大。钩虫卵与豌豆花粉颗粒形态相似；不完整的带绦虫卵与十字花科油菜花粉颗粒形态相似；蛲虫卵与蔷薇科雪花梨花粉颗粒相似；受精蛔虫卵与菊科植物刺儿菜花粉颗粒以及豆科菜豆花粉颗粒形态上均相似，极易混淆而致误认，均应仔细识别[13]。

图7 华支睾吸虫卵与灵芝孢子（图片来源于临检中心）

要减少和避免EQA样本与临床粪便样本寄生虫（卵）的漏检及误诊，除涂片厚薄适中外，还需要增加检测视野，对于高度怀疑寄生虫感染的样本需要通看全片，必要时可采用浓集法检测。另外，还需要检验人员多在显微镜下观察各种寄生虫（卵），充分掌握其形态特点。本实验室将查见寄生虫（卵）的EQA样本制作成混合虫卵样本，与EQA图片和图谱一起，供日常镜下形态识别、学习和考核比对，以进一步提高寄生虫形态学检验能力。

通过对寄生虫形态学EQA资料阶段性的回顾分析，不仅可以了解过去8年本实验室在EQA中出现的错误和出现该类错误的频率，还可以作为以后某一阶段回顾性分析的参考资料。通过参加寄生虫EQA活动，使粪便常规中寄生虫检验的质量得到了提高，检验人员检出和识别寄生虫的能力也得到了提升。