金刚纂中木脂素对食管鳞癌细胞的抑制作用

戚微岩，夏春磊，安柔锦，高新梅，李东平，徐寒梅，2*

（1中国药科大学江苏省合成多肽药物发现与评价中心，南京 211198；2中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京 211198）

大戟科植物包含约2 000 个种属，广泛分布在热带和温带地区［1］。大戟科植物其化学成分复杂，其中萜烯已被广泛研究。金刚纂是大戟科大戟属植物，作为一种传统药用植物，在关节炎、糖尿病、炎症和肿瘤的治疗中已得到广泛应用［2-3］。大戟属植物中的成分已被证明具有广泛的生物学活性，如细胞毒性、抗炎、抗菌以及抗HIV 病毒等活性，但针对金刚纂中的木脂素活性的报道较少［4-5］。

从植物中提取的木脂素是中药的重要成分，其中一些已被批准作为治疗药物或药物先导化合物［6］。本研究从金刚纂的地上部分中分离鉴定出5 个已知木脂素，分别为threo-1-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-2-｛4-［（E）-3-acetoxypropen-1-yl］-2-methoxyphenoxy｝propan-1，3-diol（1）、threo-1-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-2-｛4-［（E）-3-acetoxypro⁃pen-1-yl］-2-methoxyphenoxy｝propan-1，3-diol-3-ace⁃tate（2）［7］、黄花菜木脂素A（3）［8］、curcasinlignan D（4）［9］和丁香脂素（5）［10］，并研究其对食管鳞癌细胞系的抑制活性。

1 材 料

1. 1 药品与试剂

金刚纂药材地上部分采自广西壮族自治区东兰县，由云南省农业科学环境资源研究所王群副研究员进行鉴定。 Welch Ultimate XB-C18柱（20 mm × 250 mm，10 μm，上海月旭科技股份有限公司）；300 ~ 400目硅胶（青岛海洋化工工厂）；MCI凝胶（CHP20P，75 ~ 150 μm，三菱化学工业有限公司）；cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、caspase 3、caspase 9、Bcl-2、Bax 抗体（沈阳万类生物科技有限公司）；HRP 标记的山羊抗兔IgG 和GAPDH 抗体（杭州联科生物技术股份有限公司）；TBST（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（南京建成科技有限公司）RPMI-1640 培养基（以色列Biological Industries 公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries 公司）；CDCl3（北京百灵威科技有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1. 2 细 胞

人食管鳞癌细胞（TE-13、KYSE-410、KYSE-450）和人正常食管上皮细胞HEEC 由江苏省合成多肽药物发现与评价中心提供

1. 3 仪 器

Avance-500M 核磁共振光谱仪（德国Bruker 公司）；1100 ESI/TOF 质谱仪（美国Agilent 公司）；LC-6AD 半制备高效液相色谱（日本Shimadzu 公司）；MACS Quant 流式细胞仪（德国Mitenyi 公司）；Multiskan FC酶标仪（美国Thermo公司）；5200全自动化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）；IX53倒置显微镜（日本Olympus公司）。

2 方 法

2. 1 金刚纂木脂素的分离提取

金刚纂地上部分2 kg，室温下95% 乙醇提取3次（10 L × 3），得到乙醇提取物300 g。残余成分使用水重悬，上清液分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分（92 g）通过MCI 凝胶柱以甲醇-水（3∶7 ~ 1∶9）洗脱。90% 馏分（12 g）采用硅胶柱色谱（CC），石油醚-乙酸乙酯（30∶1 ~ 1∶1）洗脱，分离得到6 个馏分（Fr. 1 ~ Fr. 6）。Fr. 2 通过硅胶柱（CHCl3-MeOH，150∶1）和半制备HPLC（CH3CN-H2O，40∶60，3 mL/min）分离，用于制备化合物1（2. 1 mg，20. 6 min）与化合物2（3. 9 mg，19. 8 min）。Fr. 3c 通过硅胶色谱（CHCl3-MeOH，150∶1）分离得到2 个组分，Fr. 3a 和Fr. 3b。Fr. 3a通过HPLC（CH3CN-H2O，35∶65，3 mL/min）纯化得到化合物4（5. 1 mg，40. 8 min）。Fr. 3c 通过Sepha⁃dex LH-20（MeOH）凝胶色谱分离得到化合物3（8. 9 mg）和化合物5（2. 3 mg）。

2. 2 细胞毒活性检测

将人食管鳞癌细胞（TE-13、KYSE-410、KYSE-450）和人正常食管上皮细胞HEEC 用含有10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基，37 ℃，5%CO2环境培养。细胞密度达到70% ~ 90% 时，用0. 25% 胰蛋白酶溶液重悬分离培养，调节密度为每毫升3. 0 ×104个细胞，接种于96 孔板，每孔100 μL，培育过夜。以紫杉醇作为阳性对照，以不同浓度化合物给予细胞，孵育48 h，每孔终体积200 μL。孵育后，每孔加入5 mg/mL MTT 试剂20 μL，37 ℃，5%CO2孵育4 h，设一组不含药物孔为对照孔。除去培养基，每孔用DMSO 100 μL，用Thermo 酶标仪在570 nm处检测吸收度，并在630 nm处进行校正。

2. 3 细胞凋亡检测

细胞凋亡检测步骤按照试剂盒说明书进行。将KYSE-410 细胞接种于6 孔板中，培养过夜，第2 天加入不同浓度的化合物2（终浓度为1，2，4 μg/mL）。孵育24 h后，收集细胞并使用PBS缓冲液轻柔冲洗，然后加入结合缓冲液500 μL 重悬细胞，最终得到浓度为每毫升8 × 106个细胞的重悬液。在细胞悬液中加入Annexin V-Light 650 5 μL和碘化丙啶10 μL，室温避光反应10 min，然后通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2. 4 Western blot检测

对线粒体凋亡通路相关蛋白，包括Bax、Bcl-2、caspase-3/cleaved caspase-3 及 caspase-9/cleaved caspase-9 进行检测，使用GAPDH 作为内参。将KYSE-410细胞接种于6孔板内，培养过夜，并在第2天使用不同浓度的化合物2（终浓度为1，2，4 μg/mL）处理。孵育24 h 后，使用冷PBS 清洗，并使用含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液在4 ℃裂解30 min，裂解后使用12 000 r/min，4 ℃离心20 min。蛋白质浓度通过BCA 定量试剂盒检测。 然后进行SDSPAGE 电泳，上样后80 V 恒压电泳，湿转恒流转膜，5% 脱脂奶粉封闭2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min，4 ℃孵育一抗过夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，室温孵育二抗2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min。采用Tanon 5200 图像系统采集发光图像。

2. 5 软琼脂细胞集落形成实验

将中、低熔点琼脂糖放入水浴锅中，6 孔板中每孔加入含0. 8% 琼脂糖的培养基0. 5 mL，4 ℃冷却固化作为基础层。细胞用不同浓度的化合物2（终浓度为1，2，4 μg/mL）处理48 h，与0. 8% 琼脂糖混合加入孔内，冷却固化形成中层。最终，每孔加入生长培养基0. 5 mL，每孔总体积为1. 5 mL。平板在5% CO2，37 ℃环境下培养15 d，每2 ~ 3 天更换培养基。培养过程中持续观察细胞集落形成情况。第16 天，移除培养基，每孔加入含4% 甲醛和0. 01% 结晶紫的PBS 溶液1 mL 染色。1 h 后，使用PBS 冲洗每孔，直到背景清晰，随机选取5 个视野，并成像统计计数。

3 结果与讨论

3. 1 金刚纂中木脂素成分的鉴定

通过对金刚纂的乙酸乙酯部分进行分离，从中分离并鉴定出5 个木脂素类化合物（图1），通过和已有报道和实验光谱数据进行对比，最终确定这5 个化合物分别为threo-1-（4-hydroxy-3-methoxy⁃phenyl）-2-｛4-［（E）-3-acetoxypropen-1-yl］-2-me⁃thoxyphenoxy｝propan-1，3-diol（1），threo-1-（4-hy⁃droxy-3-methoxyphenyl）-2-｛4-［（E）-3-acetoxypro⁃pen-1-yl］-2-methoxyphenoxy｝propan1，3-diol-3-ace⁃tate（2）［7］，黄花菜木脂素A（3）［8］，curcasinlignan D（4）［9］和丁香脂素（5）［10］。化合物1和2均为首次从大戟属植物中分离得到。

Figure 1 Chemical structures of compounds 1-5

3. 2 MTT法检测细胞毒性

MTT 检测法是一种快速方便高通量筛选方法，可用于评估药物在细胞增殖的作用和细胞毒性［11］。食管鳞癌细胞是食管癌的主要类型，具有高发病率和致死率，在近期成为了热点医疗健康问题［12］。 本研究中应用了TE-13、KYSE-410、KYSE-450 3 种不同的食管鳞癌细胞亚型，以及人正常食管上皮细胞HEEC 对目标化合物的细胞毒性进行评估。结果表明化合物2 在以上4 种细胞内均表现出了中等的细胞毒性，其中在KYSE-410中IC50达到1. 920 μg/mL。这些数据表明化合物2可显著抑制3种食管鳞癌细胞的生长，但同时也对人类正常食管上皮细胞HEEC存在毒性。同时，与化合物1 相比，C-9′位的乙酰基可增强该类成分的细胞毒性。

3. 3 化合物2在体外促食管鳞癌细胞凋亡

化合物2对KYSE-410人食管鳞癌细胞系具有高细胞毒性。由于肿瘤细胞凋亡是影响肿瘤生存主要原因，首先测试化合物2 对细胞凋亡的影响。使用化合物2 处理KYSE-410细胞系，孵育24 h后，采用流式细胞术检测KYSE-410细胞早期和晚期凋亡情况（图2）。与对照组比较，化合物2 以剂量依赖方式诱导KYSE-410 细胞凋亡，在质量浓度为2 μg/mL 时取得最佳效果，凋亡细胞占比达到66. 26%，统计学结果如图2-E中所示。

Table 1 Cytotoxicity [IC50 (μg/mL)] of compounds 1-5 from the aerial parts of E． neriifolia L. against five esophageal squamous cancer cells and one human normal esophageal epithelial cells (HEEC) (±s, n = 5)

Table 1 Cytotoxicity [IC50 (μg/mL)] of compounds 1-5 from the aerial parts of E． neriifolia L. against five esophageal squamous cancer cells and one human normal esophageal epithelial cells (HEEC) (±s, n = 5)

Compound 1 2 3 4 5 Taxol IC50/(μg/mL)HEEC＞20 16.600±0.18＞20＞20＞20 0.008±0.002 KYSE-410＞20 1.920±0.21＞20＞20＞20 0.0047±0.001 KYSE-450＞20 3.432±0.14＞20＞20＞20 0.005±0.007 TE-13＞20 20.045±0.23＞20＞20＞20 0.063±0.008

3. 4 化合物2通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡

线粒体途径的主要特征是线粒体参与凋亡通路，异常激活的caspase 相关蛋白在诱导线粒体凋亡中起到重要作用［13］。如结果图3所示，给予化合物2后，通过Western blot检测，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达水平均有上调，而caspase 3和caspase 9 的表达水平则基本无变化，表明化合物2 是通过促进caspase 相关蛋白的激活，诱导细胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族通过线粒体应激在细胞凋亡中发挥重要作用。Bax 和Bcl-2 均属于Bcl-2 蛋白家族。Bcl-2 是细胞凋亡抑制因子，而Bax 则发挥促细胞凋亡功能。Bcl-2 和Bax 蛋白的表达水平对凋亡有关键影响［14］。化合物2 可以剂量依赖方式显著上调Bax 的表达水平，同时下调Bcl-2 的表达，结果如图3中所示。但采用流式细胞术检测凋亡实验中，化合物2在2 μg/mL时的效果最好，凋亡细胞占比达到66. 26%，综合其对于caspase 3 和caspase 9的影响，表明化合物2 不仅仅是通过作用于对于Bcl-2 蛋白家族而产生的凋亡作用，而是通过影响多个蛋白而产生的综合效果。综上所述，化合物2可激活caspase 3和caspase 9，上调Bax 的表达并抑制Bcl-2表达，并进一步以此调节细胞凋亡。

Figure 2 Compound 2 induced KYSE-410 cells apoptosis

3. 5 细胞集落形成实验

肿瘤干细胞被认为在肿瘤的形成、恶化和化疗药物耐药中发挥重要作用［15-17］。靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤疗法被认为具有良好的发展前景。集落形成实验是检测肿瘤细胞干性的常用方法［15］。食管鳞癌细胞KYSE-410 按不同分组，提前给予化合物2，孵育48 h。如结果（图4）所示，与对照组相比，当化合物2 质量浓度为2 μg/mL 时，可显著抑制细胞集落形成。这也进一步证明了流式细胞术检测的结果，即化合物2 在2 μg/mL 时具有较好的抑制凋亡的作用。

Figure 3 Compound 2 induced KYSE-410 cells apoptosis through mitochondrial pathway. KYSE-410 cells were treated with compound 2 for 24 h at 1, 2 and 4 μg/mL to detect the expression of related proteins by Western blot (±s, n = 3)

Figure 4 Cells pretreated with the compound 2 exhibited a good inhibition of colony formation capacity in KYSE-410 cells (±s, n = 5)

4 结 论

本研究对金刚纂地上部分中分离得到的5 个已知木脂素类化合物进行活性研究，发现化合物2对食管鳞癌细胞具有较好的细胞毒活性，并显著抑制细胞集落形成。此外，化合物2可通过调控线粒体凋亡通路促进KYSE-410 细胞的凋亡，值得进一步深入研究。