达格列净对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞凋亡及氧化应激的影响

汪 洋，王 可，刘宝兰

0引言

据调查研究显示，截止2035年全球糖尿病发病率将增加55%，7次全国性糖尿病调查中，我国糖尿病发病率增长了17倍，糖尿病可引起多种并发症，其中糖尿病视网膜病变是其主要并发症之一，视网膜血管病变、视网膜神经退行性病变等是糖尿病视网膜病变的主要临床表现[1-4]。达格列净属于钠-葡萄糖转运蛋白2的抑制剂，可减少机体对葡萄糖的吸收，其可用于控制2型糖尿病，但关于其对糖尿病视网膜病变的影响及其作用机制尚未阐明[5]。叉头框转录因子O4(Forkhead Box Protein O4，FOXO4)在高糖诱导的视网膜内皮细胞中表达水平升高，miR-96-5p可靶向FOXO4抑制高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡，减轻细胞损伤[6]。但达格列净是否可调控FOXO4而参与高糖诱导人视网膜血管内皮细胞(HRVECs)损伤过程尚未可知。因此，本研究采用高糖诱导HRVECs建立细胞损伤模型，探讨达格列净对高糖诱导HRVECs凋亡、氧化应激的影响及其对FOXO4的调控作用。

1材料和方法

1.1材料达格列净(20191103)购自阿斯利康制药有限公司；HRVECs购自美国ScienCell；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000试剂购自美国Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；pcDNA购自武汉淼灵生物科技有限公司；SOD(20191002)、MDA(20191005)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；si-NC(UGUCAGUCGAUGCUAGUCGAU)、si-FOXO4(UAGUCAGUCGUAGCUAGUCGAUCG)、pcDNA(CAUGUACGUAGCUGAUC)、pcDNA-FOXO4(AUGUCGAUCGUAGCUAUC)购自上海吉玛制药技术有限公司；RIPA裂解液(20190905)、BCA定量检测试剂盒(20190506)、ECL试剂(20190916)购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗人FOXO4多克隆抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1实验分组HRVECs细胞培养后，在6孔板中培养，分别培养于含5.5mmol/L D-葡萄糖的培养液中，将其置于培养箱内继续培养24h为正常糖组。HRVECs培养于含25mmol/L D-葡萄糖的培养液中，将其置于培养箱内继续培养24h[7]为高糖组。HRVECs分别培养于含有不同浓度(1、5、10ng/L)达格列净与25mmol/L D-葡萄糖的培养液中[8]，将其置于培养箱内继续培养24h分别为高糖+达格列净低剂量组、高糖+达格列净中剂量组、高糖+达格列净高剂量组。将si-NC、si-FOXO4分别转染入HRVECs后加入25mmol/L D-葡萄糖的培养液培养24h，分别为高糖+si-NC组、高糖+si-FOXO4组。pcDNA、pcDNA-FOXO4分别转染入HRVECs后加入10ng/L达格列净与25mmol/L D-葡萄糖的培养液中，将其置于培养箱内继续培养24h分别为高糖+达格列净高剂量+pcDNA组、高糖+达格列净高剂量+pcDNA-FOXO4组。

1.2.2流式细胞术检测细胞凋亡率取各组HRVECs，采用PBS洗涤细胞后加入0.25%胰蛋白酶，将DMEM培养液加入其中后制备细胞悬液，将其放入15mL的离心管内，1 000r/min转速离心5min后弃上清，将预冷PBS加入其中后离心弃上清，加入100μL Binding Buffer后分别将5μL Annexin V-FITC与1μL PI染液加入其中，室温避光孵育15min后将400μL Binding Buffer加入其中，于1h内应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3检测SOD和MDA的水平严格按照试剂盒说明书进行操作，采用反复冻融法裂解各组HRVECs，用黄嘌呤氧化酶法检测SOD的水平，用硫代巴比妥酸法检测MDA的水平。

1.2.4Westernblot检测FOXO4蛋白表达取各组HRVECs加入500μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒说明书操作检测蛋白浓度，将5×SDS上样缓冲液加入蛋白样品中，将其置于沸水中煮10min蛋白变性，取50μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳反应，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜后使用5%脱脂奶粉封闭2h，分别加入一抗稀释液(1∶1000)后置于4℃条件下孵育24h，采用TBST洗涤后加入稀释比为1∶5000的二抗稀释液，将其置于室温条件下孵育1h，采用TBST洗涤后滴加ECL显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。同时采用脂质体转染法将si-NC、si-FOXO4、pcDNA、pcDNA-FOXO4分别转染至HRVECs后按照上述方法检测FOXO4蛋白相对表达量。

2结果

2.1达格列净对高糖诱导HRVECs凋亡的影响各组凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.01)。与正常糖组比较，高糖组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+达格列净中剂量组、高糖+达格列净高剂量组细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1，表1。

图1 达格列净对高糖诱导HRVECs凋亡的影响 A:正常糖组;B:高糖组;C:高糖+达格列净低剂量组;D:高糖+达格列净中剂量组;E:高糖+达格列净高剂量组。

2.2达格列净对高糖诱导HRVECs氧化应激的影响各组SOD和MDA比较差异均有统计学意义(P<0.01)。与正常糖组比较，高糖组SOD的水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，MDA的水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+达格列净中剂量组、高糖+达格列净高剂量组SOD的水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，MDA的水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3达格列净对高糖诱导HRVECs中FOXO4蛋白表达水平的影响各组FOXO4蛋白表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)。与正常糖组比较，高糖组FOXO4蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+达格列净中剂量组、高糖+达格列净高剂量组FOXO4蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1，图2。

图2 达格列净对高糖诱导HRVECs中FOXO4蛋白表达情况的影响。

表1 达格列净对高糖诱导HRVECs凋亡和氧化应激的影响

2.4FOXO4过表达和抑制转染效率的检测与si-NC组(0.25±0.03)比较，si-FOXO4组FOXO4蛋白表达水平(0.11±0.01)降低，差异有统计学意义(t=7.668，P=0.002)；与pcDNA组(0.24±0.03)比较，pcDNA-FOXO4组FOXO4蛋白表达水平(0.69±0.07)升高，差异有统计学意义(t=10.234，P=0.001)，见图3。

图3 FOXO4蛋白表达情况。

2.5抑制FOXO4对高糖诱导HRVECs凋亡和氧化应激的影响与高糖+si-NC组比较，高糖+si-FOXO4组细胞凋亡率降低，SOD的水平升高，MDA的水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2，图4。

表2 抑制FOXO4对高糖诱导HRVECs凋亡和氧化应激的影响

图4 抑制FOXO4对高糖诱导HRVECs凋亡和FOXO4蛋白表达的影响 A：流式细胞术检测细胞凋亡率；B：Western blot检测FOXO4蛋白表达量。

2.6过表达FOXO4对高糖诱导HRVECs凋亡和氧化应激的影响与高糖+达格列净高剂量+pcDNA组比较，高糖+达格列净高剂量+pcDNA-FOXO4组凋亡率升高，SOD的水平降低，MDA的水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3，图5。

表3 过表达FOXO4对高糖诱导HRVECs凋亡和氧化应激的影响

图5 过表达FOXO4对高糖诱导HRVECs凋亡及FOXO4蛋白表达的影响 A：流式细胞术检测细胞凋亡率；B：Western blot检测FOXO4蛋白表达量。

3讨论

体内持续高糖水平是诱导患者视网膜病变的重要原因之一，氧化应激、细胞凋亡等是促进糖尿病视网膜病变的主要诱导因素，目前糖尿病视网膜病变的发病机制尚未完全阐明，因而深入探究糖尿病视网膜病变的发病机制，以及研发有效预防及治疗药物均具有重要意义，既往研究证实，天麻素通过调节SIRT1/TLR4/NF-κBp65信号通路抑制高糖诱导的人视网膜内皮细胞凋亡[9]。山奈酚靶向雌激素相关受体α，并在高葡萄糖条件下抑制人视网膜内皮细胞的血管生成[10]。绿原酸可通过降低VEGF的表达并抑制VEGF介导的视网膜新血管生成而减轻糖尿病视网膜病变[11]。但仍有部分药物对糖尿病视网膜病变的作用机制尚未阐明。

达格列净是一种新型的降糖制剂，其具有降压、降血糖等作用，并可预防及减轻糖尿病心血管并发症的发生及发展[12]。达格列净可明显改善糖尿病心肌缺血大鼠心功能，并可恢复其心肌及血管功能[13]。本研究结果显示，高糖诱导的HRVECs凋亡率升高，而达格列净可明显降低高糖诱导的HRVECs凋亡率，且达格列净高剂量细胞凋亡率明显低于达格列净中剂量组，提示达格列净可抑制高糖诱导的HRVECs凋亡。氧化应激是高糖诱发内皮细胞凋亡的重要原因之一，SOD属于抗氧化酶，若MDA等过氧化酶类生成量过多可促进细胞内氧化应激反应的发生，进而通过一系列通路促进细胞凋亡[14-15]。本研究结果显示，高糖诱导的HRVECs中SOD的水平降低，MDA的水平升高，与上述研究报道结果相似，而达格列净可明显提高高糖诱导的HRVECs中SOD的水平，降低MDA的水平，且达格列净中剂量组、达格列净高剂量组间SOD、MDA的水平比较具有明显差异，提示达格列净可抑制高糖诱导的HRVECs氧化应激而抑制细胞凋亡从而减轻细胞损伤。

为进一步探究达格列净治疗糖尿病视网膜病变的作用机制，本研究采用Western blot实验检测FOXO4的表达量，本研究结果显示，高糖诱导的HRVECs中FOXO4蛋白水平升高，而达格列净可明显降低高糖诱导的HRVECs中FOXO4蛋白水平，且达格列净高剂量组FOXO4蛋白水平明显低于达格列净中剂量组，提示达格列净可能通过下调FOXO4而发挥作用。FOXO4属于叉头框蛋白家族成员，其可通过影响细胞生物学行为而发挥作用，研究表明FOXO4表达异常与糖尿病并发症的发生密切相关，糖尿病视网膜病变中FOXO4的表达水平升高，抑制FOXO4表达可明显降低高糖诱导的细胞氧化应激及抑制细胞凋亡[16]。FOXO4高表达可促进心肌梗塞后的早期炎症反应[17]。miR-328-3p通过靶向FOXO4减轻低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤[18]。本研究结果显示，pcDNA组是空载体，是过表达的对照，FOXO4过表达与达格列净高剂量联合处理高糖诱导的HRVECs，结果显示，细胞凋亡率升高，SOD的水平降低，而MDA的水平升高，提示FOXO4过表达可明显逆转达格列净对高糖诱导HRVECs凋亡及氧化应激的作用。

综上所述，达格列净可通过抑制FOXO4的表达而抑制高糖诱导的HRVECs氧化应激及抑制细胞凋亡从而减轻细胞损伤，FOXO4可能作为达格列净治疗糖尿病视网膜病变的潜在靶标，但关于其具体作用机制仍需进一步探究。