荷斯坦牛免疫抗病相关Nramp1基因生物信息学分析

张梦帆，李耀东

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

Nramp基因属于天然抗性相关巨噬细胞蛋白（natural-resist-ance-associated macrophage protein,Nramp）家族，又称为溶质载体家族11成员（solute carrier11,SLC11）[1]。Nramp基因广泛存在于细菌、真菌和动植物中，在所有生命体中具有高度保守的序列，主要分为Nramp1（SLC11A1）和Nramp2（SLC11A2）两种，Nramp1基因主要在吞噬细胞和中性粒细胞中特异性表达，Nramp2基因在众多组织和细胞广泛表达[2]。Nramp1基因长度为12kb，包含15个外显子，有着高度同源性的氨基酸序列和相似的二级结构[3]。其所编码蛋白具有10～12个预测的跨膜结构域，位于吞噬体膜，参与二价阳离子的转运。通过转运Fe2+、Mn2+等离子不仅保护巨噬细胞不产生活性氧，而且还可使细菌失去自身防御酶系统所必需的离子[4]。

荷斯坦牛属于大型乳用牛品种，体格较大，乳房炎为其常见病之一。牛的Nramp1基因位于牛2号染色体q43-44区域，长度约10.1kb。研究表明，Nramp1基因与多种传染病和细胞内寄生虫病抵抗力相关，不仅影响动物的IgM、淋巴细胞转化率等部分免疫指标，还与动物的产奶量、体重等多种生产性能密切相关[5]。本文主要对荷斯坦牛的Nramp1基因展开研究，旨在通过对这一基因的生物信息学分析为今后牛的免疫抗病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

荷斯坦牛Nramp1基因编码的氨基酸序列来自于GenBank，登录号为DQ493965.1。

1.2 方法

对荷斯坦牛Nramp1基因进行生物信息学分析，利用软件分析其编码蛋白的基本理化特性和高级结构，需要应用的工具软件与网址见表1。

表1 荷斯坦牛Nramp1基因生物信息学分析方法

2 结果与分析

2.1 荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白质理化性质分析

由ProtParam软件预测结果可知，荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白质的分子式为C2761H4300N680O742S21，氨基酸数为548个，所含的氨基酸数目及比例见表2。其分子质量大小为59 565.88，理论等电点为6.39。带负电残基总数（Asp+Glu）为35个，正电荷残基总数（Arg+Lys）为33个。在体外，哺乳动物网织红细胞内，预估半衰期为30h；在体内，在酵母中预估半衰期大于20h，大肠杆菌中预估半衰期大于10h。不稳定指数为47.06，这说明荷斯坦牛的Nramp1基因编码蛋白为不稳定蛋白。疏水性总平均值（GRAVY）为0.554，这类蛋白为疏水蛋白。

表2 荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白的氨基酸组成

2.2 荷斯坦牛Nramp1编码蛋白质疏水性/亲水性分析

利用ProtScale在线预测荷斯坦牛Nramp1蛋白的亲/疏水性，结果见图1。由图1可知，疏水区最大值为第472位氨基酸（+2.922），这一位置氨基酸为亮氨酸；亲水区最小值为第541位氨基酸（-3.100），这一位置氨基酸为谷氨酰胺。由ProtParam对荷斯坦牛Nramp1蛋白的预测结果显示，其平均疏水性为0.554。ProScale的预测结果显示，荷斯坦牛Nramp1蛋白的疏水肽链分布在整个氨基酸序列中，且明显多于亲水性肽链，两个预测结果均证明荷斯坦牛Nramp1蛋白是一种疏水蛋白质。由此可推测荷斯坦牛Nramp1基因编码的蛋白质是一种不可溶性蛋白质。

图1 荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白质的亲/疏水性预测

2.3 荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白质的信号肽预测

用以引导蛋白质跨膜移动的氨基酸序列的N-末端在新合成多肽链中称为信号肽，是指导粗面内质网上分泌蛋白合成的决定性因素[6]。经过分析可以看出，使用SignalP5.0在线软件对Nramp1基因编码的氨基酸序列的信号肽进行预测（图2），荷斯坦牛Nramp1基因编码序列不存在任何信号肽的概率为0.9948，因此可知Nramp1蛋白不具有分泌信号肽的特征。

图2 荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白质的信号肽预测

2.4 荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白的跨膜结构域预测

通过在线工具TMHMM进行跨膜结构预测，预测结果如图3显示。可以看出荷斯坦牛Nramp1蛋白存在11处明显的跨膜结构域（81～103、133～155、165～184、196～218、238～260、281～303、346～368、398～415、430～452、459～481、491～513），其余非跨膜结构域中有6处（1～80、156～164、219～237、304～345、416～429、482～490）位于膜外，6处（104～132、185～195、261～280、369～397、453～458、514～548）位于膜内。

图3 荷斯坦牛Nramp1蛋白跨膜结构预测

2.5 荷斯坦牛Nramp1蛋白N-糖基化位点及磷酸化位点预测

N-糖基化位点和磷酸化位点分别经NetNGlyc 1.0 Server和NetPhos 3.1 Server软件进行预测，结果表明，荷斯坦牛Nramp1蛋白第335位氨基酸处存在1处N-糖基化修饰位点（如图4所示），且存在41个潜在磷酸化位点（阈值＞0.5）。位点预测得分若仅略高于阈值（0.5），则表明该预测位点作为一个真正磷酸化位点的可信度较低。一般来说，位点预测得分越高，预测的可信度越高。结果如图5所示，包括27个Ser(Ser17、Ser19、Ser20、Ser23、Ser37、Ser51、Ser77、Ser145、Ser158、Ser161、Ser229、Ser258、Ser263、Ser269、Ser290、Ser322、Ser323、Ser371、Ser393、Ser403、Ser422、Ser433、Ser468、Ser487、Ser527、Ser528、Ser547);13个Thr(Thr34、Thr45、Thr59、Thr114、Thr153、Thr206、Thr311、Thr375、Thr377、Thr401、Thr409、Thr514、Thr522)及1个Try（Thr211）。

图4 荷斯坦牛Nramp1蛋白N-糖基化位点预测

图5 荷斯坦牛Nramp1蛋白磷酸化位点预测

2.6 荷斯坦牛Nramp1蛋白质二级结构和三级结构预测

蛋白质的二级结构主要是借助多肽链空间盘曲折叠而产生，其氢键的组成部分是C=O以及N-H基团[6]。经过对其二级结构的预估结果（图6）观察可以发现，其中无规则卷曲（Cc）的数值是40.69%，α-螺旋（Hh）的数值是42.88%，延伸链（Ee）为16.42%，其中不存在β转角（Tt）。三级结构的预测结果见图7，经采用ExPASy-SWISS-MODEL在线软件，选取与氨基酸序列相似性最高序列，显示荷斯坦牛Nramp1蛋白三维模型QMEAN值为－6.25，GMQE值为0.63，模型相似性为31.72%。

图6 荷斯坦牛Nramp1蛋白质二级结构预测

图7 荷斯坦牛Nramp1蛋白质三级结构预测

2.7 荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白互作网络分析

由STRING分析发现，Nramp1基因编码蛋白与其互作蛋白相关性均在0.95以下。Nramp1与CYBB的相关性最高，高达0.937。CYBB为细胞色素b-245重链，是呼吸链的末端组成部分，是吞噬细胞膜结合氧化酶的关键成分。它将单个电子从细胞质NADPH穿过质膜传递到外部，也作为电压门控质子通道，介导静息吞噬细胞的H（+）电流。

蛋白互作网络分析结果表明，与Nramp1基因编码蛋白相互作用的蛋白质有非特征蛋白(CD300A)、整合素β-2（ITGB2）、C型凝集素结构域家族4成员D（CLEC4D）、溶质载体家族2易化葡萄糖转运蛋白成员3（SLC2A3）、细胞色素b-245轻链（CYBA）、IgA的Fc片段（FCAR）、细胞色素b-245重链（CYBB）、高亲和力免疫球蛋白ε受体亚单位γ（FCER1G）、ATPaseⅥ类11A型(ATP11A）、ATPaseⅠ类8B型成员4（ATP8B4）等。

图8 荷斯坦牛Nramp1基因蛋白互作网络分析

3 讨论

在免疫学中，一般认为结构复杂、分子质量在10ku以上的物质具有免疫原性，而荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白分子质量达到近60ku，这证明荷斯坦牛Nramp1蛋白具有一定的免疫作用。Nramp1基因主要在巨噬细胞、嗜中性粒细胞及外周血细胞等吞噬细胞中表达[7]，因而在先天性免疫调节中具有重要作用。Gruenheid等[8]研究发现，Nramp1蛋白主要位于巨噬细胞的内吞小体和溶酶体的膜上。Nramp1蛋白可通过螯合Fe2+和Mn2+调节细菌和真核细胞酶的活性。一方面保护巨噬细胞自身的抗氧化作用，另一方面可以降低病原体合成自身保护酶的能力[9]。且通过离子转运激活动物体内的巨噬细胞，可引起“多向性效应”的发生，从而使动物对疾病具有较强的天然抵抗力[10～12]。Vidal等[13]在研究中发现，在Nramp1基因突变至其功能丧失的情况下，小鼠只在感染早期时免疫力低下，而感染后期功能正常，说明Nramp1基因在巨噬细胞和寄生虫互作的早期免疫阶段发挥着重要作用[14]。Nramp基因和多种细胞内菌体的抗性感染相关联。在红绸鱼受到致病弧菌侵袭时，Nramp1基因mRNA的表达量显著升高[15]。团头鲂受脂多糖刺激时，Nramp1基因mRNA水平也有所上调[16]。Nramp1基因在小鼠抵抗弗朗西斯菌中起着重要作用，且对沙门氏菌、结核分枝杆菌及利什曼原虫也有着显著抗性[17]。Paixao等[18]研究发现，Nramp1基因3′UTR区序列的多态性与牛对布鲁氏杆菌抗性和易感性有关。Joo等[19]研究结果表明，抗乳腺炎奶牛的Nramp1基因表达水平高于易感奶牛，这说明Nramp1基因活性高的个体不易患乳腺炎。郭洋等[20]发现，Nramp1基因与牛的乳腺炎抗性相关。

本研究主要从生物信息学角度解析了荷斯坦牛Nramp1基因的部分信息。预测结果表明其本质是一种不稳定疏水蛋白，二级结构预测显示以无规则卷曲与α-螺旋结构结构为主。荷斯坦牛Nramp1蛋白有27个Ser和13个Try和1个Try，总计41个潜在的磷酸化位点，这些位点可能影响到某些细胞的代谢过程和信号转导。通过利用生物软件分析荷斯坦牛Nramp1基因的生物信息学内容，有利于辅助开展关于Nramp1基因的相关科学研究，并且能为其深入研究提供一些基础资料。