基于生物信息学检测NSUN2 基因在胶质瘤中的表达及临床意义

张 群，田秋思，唐铖铖，冯 光，路宏朝

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.三二〇一医院神经外科，陕西 汉中 723000）

人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，预后差，其中以多形性胶质瘤（glioblastoma multiforme，GBM）恶性程度最高，患者总生存时间仅10～15 个月[1]。人脑胶质瘤的发病机制非常复杂，具体机制仍不清楚。相关基因表达异常在人脑胶质瘤尤其是NSUN2 的发生、发展中起着至关重要的作用[2]。因此，筛选人脑胶质瘤特异且敏感的差异表达基因有助于认识人脑胶质瘤，同时有利于人脑胶质瘤的早期诊断和精准治疗。5-甲基细胞嘧啶（m5C）通过RNA 代谢调节，特别是RNA 稳定性、RNA 导出RNA、mRNA 翻译和RNA 处理参与肿瘤的发生[3，4]。NOP2/Sun 结构域家族成员2（NSUN2）也被称为MYC 诱导的SUN 结构域含蛋白（Misu），是催化m5C 形成的主要m5C 修饰酶。根据免疫组化学（IHC）分析，NSUN2 在各种肿瘤中均高度表达，包括食管、肝脏、胰腺、子宫颈、肾、胃、甲状腺和乳腺癌[5-8]。研究表明[4]，NSUN2 通过与其3'-UTR 中的m5C 修饰位点结合稳定HDGF癌基因的mRNA 来促进膀胱癌的进展。然而，关于NSUN2 在神经胶质瘤中的作用的研究还很少。本研究使用癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据集分析NSUN2 基因在正常脑组织与GBM 中的表达差异，以及NSUN2 与GBM 患者临床病理特征的相关性，旨在为深入研究GBM 的靶向治疗提供思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源 从TCGA（https:/lcancergenome.nih.gov/）数据库下载GBM 的mRNA 表达谱数据，包含1150 例正常脑组织和689 例GBM 组织，同时下载对应的患者临床资料，采用R 软件和Perl 语言预处理数据。

1.2 数据集筛选和差异表达分析 剔除TCGA 数据集中临床病理参数不完整及缺乏预后随访资料的样本，仅保留同时包含临床参数和生存数据的样本，利用Wilcoxon 秩和检验确定NSUN2 基因在正常脑组织和GBM 组织中的表达差异，采用R 软件（3.5.2）的“limma”软件包完成差异分析并绘制差异散点图[9]。

1.3 生存分析与临床相关性分析 根据样本中NSUN2 基因表达的中位值将NSUN2 分为高表达组和低表达组，采用R 软件的“survival”软件包进行生存分析，采用“survminer”软件包绘制生存曲线，单因素和多因素Cox 风险模型分析临床参数与GBM 预后的关系，并计算风险比（hazard ratio，HR）。

1.4 基因集富集分析 采用CSEA 软件（4.0.2）（http:/lsoftware.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）进行富集分析。采用CSEA 网站的MsigDB 数据库获取c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 数据集，设置分析置换次数为1000 次，显著富集基因集需满足以下条件：错误发现率（false discovery rates，FDR）＜0.25，P＜0.05。

1.5 mRNA 和蛋白质表达验证实验 选取符合纳入和排除标准9 例胶质瘤组织与癌旁正常组织标本作为本实验的验证对象。纳入标准：在西安交通大学附属三二〇一医院明确诊断为GBM 的患者；IBM为18.5～25 kg/m2；年龄20～65 岁。排除标准：存在严重的心、肺、肾等严重的内科合并症；临床资料不完整。按照Trizol 试剂说明书提取细胞总RNA 后，采用逆转录试剂盒（Accurate）进行RNA 逆转录实验。逆转录后的cDNA 用于进行实时荧光定量实验，以小鼠GAPDH 作为内参。同时，选取的5 例患者标本所制作的5 组GBM 组织和癌旁组织的石蜡切片，将5 组患者胶质瘤与癌旁标本通过三步法进行NSUN2 作为一抗的免疫染色，观察免疫染色后的阳性结果的表达，本实验采用DAB 染色，阳性结果显色为黄褐色。其中一抗采用Cell Signaling Technology 的NSUN2 兔源多克隆抗体。引物序列见表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.6 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用（）表示，组间比较采用配对t检验；计数资料以（%）表示，组间比较采用χ2检验，采用单因素和多因素Cox 回归分析挑选预后相关因子，相关性分析采用皮尔森相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSUN2 在GBM 组织中的表达情况 NSUN2 在GBM 组织中的表达高于正常脑组织，差异有统计学意义（P<0.05）﹐见图1。

图1 NSUN2 在GBM 组织中的表达情况

2.2 NSUN2 表达情况与GBM 患者临床病理特征的关系 NSUN2 表达与GBM 患者预后呈负相关，见图2。不同年龄、临床分期、TP53 分型的GBM 患者NSUN2 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），不同性别的GBM 患者NSUN2 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。单因素Cox 回归分析显示，NSUN2 mRNA 的高表达、WHO 分级、应答深度、1p/19q 杂合性缺失以及IDH1 基因野生型可降低患者的总生存期，性别与患者预后无关；将上述有统计学意义的因素纳入多因素的Cox 回归模型分析，结果显示治疗结果、IDH1 基因野生型和年龄是患者总生存期的独立影响因素，见表2。

表2 GBM 预后影响因素的单因素、多因素Cox 回归分析

图2 NSUN2 基因mRNA 表达与GBM 患者预后的相关性

图3 NSUN2 表达与临床病理特征的关系

2.3 基因集富集分析 GSEA 分析结果表明，NSUN2基因高表达组GBM 样本主要富集于视网膜母细胞瘤、合成蛋白、整合素、反应性胶原形成信号通路，见图4。

图4 NSUN2 相关富集基因集

2.4 NSUN2 mRNA 在GBM 组织中的表达情况q-PCR实验显示，NSUN2 mRNA 的表达在GBM 组织中上调，见图5，其中NSUN2 mRNA 在GBM 组织中的表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。IHC 实验结果显示，NSUN2 在GBM 组织呈中等程度的胞核阳性，且NSUN2 mRNA 在GBM 组织的表达水平高于癌旁组织，见图6。

图5 NSUN2 mRNA 在GBM 组织和癌旁组织的表达比较

图6 NSUN2 蛋白在GBM 组织和癌旁组织的表达比较

3 讨论

本研究显示，NSUN2 在GBM 中的表达高于癌旁组织组，NSUN2 高表达组的总生存期低于低表达组（P＜0.05），提示NSUN2 高表达是GBM 患者预后的危险因素。另外，本研究采用qPCR 技术和IHC 实验验证了胶质瘤组织中NSUN2 表达上调。有报道显示，包括NSUN2 在内的几种RNMT 的表达在DNA拷贝数和mRNA 表达之间具有正相关性，并且与乳腺癌患者的更高级别侵袭性亚型和不良预后相关[10]。在皮肤癌中，NSUN2 的表达缺失与恶性肿瘤的增加相关[11]。在卵巢癌中，NSUN2 低表达和IGF2 高表达的患者具有较差的总体和无疾病进展生存率，因此NSUN2/IGF2 信号已被确定具有预后生存价值[12]。另有研究发现，NSUN2 在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中的表达上调约2 倍，这与患者的总生存期缩短和较高的死亡率风险相关[13]。此外，NSUN2 高表达与HNSCC 中的T 细胞活化相关，NSUN2 低表达患者的T 细胞活化评分与死亡率之间存在正相关，这表明HNSCC 中NSUN2 表达可作为免疫检查点的标志物[14]。有研究明确了NSUN2 在胃癌中的作用，发现NSUN2 通过以m5C 依赖的方式抑制细胞周期蛋白依赖性激酶p57Kip2，在体外和体内促进癌细胞增殖[15]。这些研究均证明了NSUN2 在肿瘤中的重要作用，但NSUN2 在胶质瘤中的作用还需要进一步阐明。

本研究中，单因素和多因素Cox 的分型显示，NSUN2 和病理分级在GBM 中是两个独立预后因子。在与GBM 患者临床特征关系的研究中发现，不同年龄、病理分级﹑性别以及肿瘤分期的GBM 患者NSUN2 表达均有差异。进一步对NSUN2 高低表达组进行差异分析，并对所得的差异基因进行功能富集﹐发现差异基因主要和整合素及蛋白聚糖相关通路有关，这也提示蛋白代谢可能参与GBM 的发生发展。蛋白质合成是所有细胞的基本过程，但其在发育、干细胞和癌症中的精确调控作用尚不清楚。研究显示，NSUN2 在m5C 转录后甲基化转移RNA（TRNA）是一种新的抑制蛋白质合成的机制[16，17]。NSUN2 的缺失导致tRNA 的低甲基化，使血管生成素能够内切tRNA，并积累5'tRNA 片段[16-19]，这些片段可抑制帽依赖的蛋白质翻译[20-22]，这与GSEA 富集的结果一致。还有研究显示[23]，NSUN2 基因双等位基因功能的缺失变异与青少年白内障或脑异常疾病相关，提示NSUN2 与GBM 存在的相关性。GSEA 分析显示，NSUN2 高表达组在视网膜母细胞瘤相关通路中有显著富集。

综上所述，GBM 组织中NSUN2 基因呈高表达状态，并且与患者的临床病理特征密切相关，可以为GBM 诊断和治疗的提供新思路。